人白介素-12植物表達(dá)體系的建立.pdf

1、遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文人白介素-12植物表達(dá)體系的建立姓名：邵敏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：葛正龍20050501漣叉醫(yī)學(xué)院碩士畢業(yè)論文 人白介素一l 2 植物袁迭體系的建立人白介素一1 2 植物表達(dá)體系的建立研究生邵敏 導(dǎo)師葛正龍摘 要利用基因重翦l 技術(shù)，構(gòu)建人白介素一1 2 基因的植物表達(dá)載體，將h l L 一1 2 基因?qū)腭R鈴薯，獲取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，探索利用馬鈴薯作為生物反應(yīng)器表達(dá)h I I ．一1

2、 2的可行性。陽(yáng)離子脂質(zhì)體L i p o f e c t a m i n e “2 0 0 0 將質(zhì)粒p C A t 3 - h l l ，一1 2 對(duì)C O S ～7 細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，E L I S A 法檢測(cè)在細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)h l L - 1 2 蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。采用P C R 技術(shù)從質(zhì)粒p C A l 3 一h i t 。一1 2 中擴(kuò)增h I L 一1 2 基因，將h l L 一1 2 基因和植物表達(dá)載體p B ] 1 2

3、1經(jīng)S m aI 、S a c l 雙酶切，T 。D N A 連接酶連接目的基因和基因載體；通過(guò)三親雜交法將植物表達(dá)載體p B l l 2 1 一h l L ～1 2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌E H A l 0 5 ；將重組質(zhì)粒用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染馬鈴薯莖段，在含有卡那霉素的分化和生根培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因植株：P C R 擴(kuò)增h l L —1 2 基因進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化植株，通過(guò)E L I S A 檢測(cè)h I L 一1 2 在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達(dá)情況。結(jié)果顯

4、示，C O S 一7 細(xì)胞經(jīng)p C A l 3 - h I L 一1 2 轉(zhuǎn)染4 8 h 后，培養(yǎng)上清的h I L 一1 2 的表達(dá)水平為8 l l 。8 ±2 1 ．9 p g ／m l ，麗空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組的表達(dá)水平分別為9 1 ．5 ±8 ．6 p g ／m l 和1 0 1 ．2 ±7 ．O p g ／m l ，L - D 組( 脂質(zhì)體一質(zhì)粒D N A 組) 分別與空白劉照組和空載體對(duì)照組相

5、比均有顯著性差異( f ( O ．0 0 1 ) 。通過(guò)P C R 擴(kuò)增、酶切、測(cè)序證明已成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體p B I 1 2 1 一h i t 一1 2 。對(duì)經(jīng)過(guò)三親雜交后的農(nóng)桿菌E I I A l 0 5 進(jìn)行m i n i - T i 質(zhì)粒的抽提，P C R 、酶切鑒定。表明質(zhì)粒p B l l 2 1 - h l L - 1 2 轉(zhuǎn)化入農(nóng)豐T 菌E H A l 0 5 中。經(jīng)卡那霉素的篩選，挑取其中的2 8 株卡那霉素抗性植株

6、進(jìn)行P C R 驗(yàn)證，有2 2 株轉(zhuǎn)基因馬鈴薯擴(kuò)增出h i t ，一1 2 基因。再?gòu)腜 C R 陽(yáng)性植株中隨機(jī)選取5 株實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，經(jīng)E l ，I S A 檢測(cè)莖和葉中h I L 一1 2 的表達(dá)量，其中2 株與對(duì)照組相比有顯著性差異( 只O ．0 0 1 ) ，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯含有h I L 一1 2 的量分別為3 7 1 4 ，0 ±4 8 ．8 p g ／g 和3 4 6 5 ．O ±t 8 5 ．O p