高效表達(dá)抗菌肽PNK-19的嗜酸乳桿菌表達(dá)體系的建立.pdf

1、隨著抗生素濫用、藥物殘留的日益嚴(yán)重，抗菌肽(AMPs)以其特有的屬性引起廣大科研工作者的注意?？咕木哂蟹肿恿啃　o過敏反應(yīng)、不易產(chǎn)生耐藥性、抗菌機(jī)理獨特等特點，對細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒和腫瘤等有一定的抵抗作用，可作為保護(hù)動物和人類健康安全、有效的武器。抗菌肽是生物體先天免疫的重要組成部分，它可以破壞病原體生物膜完整性，從而保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌和病毒的侵害，然而抗菌肽的來源問題一直是制約抗菌肽研究和開發(fā)的瓶頸。為了解決這個難題，本實驗采用

2、串聯(lián)表達(dá)的方式使得抗菌肽三串聯(lián)基因在益生菌中表達(dá)，克服了抗菌肽分子量小，對宿主具有殺滅作用而難于表達(dá)的難題，同時也為抗菌肽的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　本實驗通過生物信息學(xué)方法，選擇分子量小、抗菌活性好的豬源抗菌肽Protegrins-1和牛源抗菌肽Indolicidin，通過對氨基酸的酸堿性、親水性和疏水性分析，在抗菌肽C端添加包含正電荷氨基酸的蛋白酶切位點內(nèi)肽酶-K、胰凝乳蛋白酶-F和激肽釋放酶-PRF，形成 PNK-19、LN

3、F-14和 LNK-16抗菌肽。經(jīng)活性檢測后篩選出活性較好的PNK-19抗菌肽進(jìn)行三串聯(lián)，經(jīng)反向翻譯，兩端加入限制性內(nèi)切酶XbalⅠ和HindⅢ，形成大小為228bp的三串聯(lián)基因。將目的基因和質(zhì)粒 pMG36e進(jìn)行雙酶切后，經(jīng) T4連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pMG36e-PNK-19-3E，通過PCR和雙酶切鑒定及序列測定，表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　將構(gòu)建好的pMG36e-PNK-19-3E表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取