基于抗草甘膦基因的棉花莖尖農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究.pdf

1、棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面有著至關(guān)重要的作用。草害是影響棉花生產(chǎn)的主要因素之一，對棉花的產(chǎn)量及品質(zhì)有較大的影響。運(yùn)用基因工程創(chuàng)新棉花種質(zhì)資源，培育應(yīng)用轉(zhuǎn)基因抗除草劑的棉花品種對于棉田化學(xué)除草，降低植棉投入，提高植棉效率具有重要的意義。本研究以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦除草劑基因（EPSPS-G6為外源基因，通過優(yōu)化多種轉(zhuǎn)化條件，完善了基于抗草甘膦基因的棉花莖尖農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，并將EPSPS-G6基因?qū)腌孀置?/p>

2、201、YZ-1及中棉所49等棉花品種中，創(chuàng)制出抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花種質(zhì)系。研究結(jié)果如下:
　　 1.以中棉所49、珂字棉201及YZ-1為受體材料，通過對培養(yǎng)基草甘膦濃度的篩選、農(nóng)桿菌侵染濃度、共培養(yǎng)時間以及恢復(fù)培養(yǎng)條件等因素的優(yōu)化，完善了基于抗草甘膦基因的棉花莖尖農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。研究結(jié)果表明，適合于棉花莖尖農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化法的草甘膦篩選濃度為10 mg/L;莖尖轉(zhuǎn)化體系:以20 min為農(nóng)桿菌侵染時間，農(nóng)桿菌菌液OD600為

3、0.9～1.0，共培養(yǎng)時間為48 h，選用SH培養(yǎng)基并加入適量活性炭(0.5 g/L)作為恢復(fù)培養(yǎng)基。以莖尖外植體為基數(shù)，本轉(zhuǎn)化技術(shù)的轉(zhuǎn)化成功率達(dá)6.4％。從轉(zhuǎn)化時間來看，該方法從無菌苗培養(yǎng)開始計算，獲得再生試管苗的時間僅為2個月時間，4個半月即能開花，6個月即能獲得T1代種子，說明本轉(zhuǎn)化技術(shù)具有較好的實(shí)用價值。
　　 2.以本研究建立的棉花莖尖農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將具有我校自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦基因EPSPS-G6導(dǎo)入中棉所4

4、9、珂字棉201及YZ-1等3個陸地棉品種（系）的莖尖。共轉(zhuǎn)化360個莖尖，共獲得60株抗性再生植株，經(jīng)分子檢測和草甘膦篩選后移栽成活23株。
　　 3.對再生植株(T0)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，26株再生植株中能擴(kuò)增出與質(zhì)粒DNA相同大小條帶，初步說明外源基因已成功地整合到再生植株的染色體DNA中。Southern雜交鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的外源基因均為單拷貝。轉(zhuǎn)基因T0植株主要田間農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明，轉(zhuǎn)EPSPS-