農(nóng)桿菌活體轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化與高抗草甘膦棉種質(zhì)的創(chuàng)制.pdf

1、棉花是唯一可由種子生產(chǎn)纖維的農(nóng)作物，棉花生產(chǎn)需要投入較多勞動(dòng)力。由于勞動(dòng)力的轉(zhuǎn)移，我國的人工價(jià)格不斷上漲，植棉的比較效益和經(jīng)濟(jì)效益下降，導(dǎo)致近年我國棉花生產(chǎn)的連年滑坡。我國的棉花生產(chǎn)仍以人工作業(yè)為主，其中棉田除草是植棉用工的主要內(nèi)容之一，占植棉用工的1/3以上。草甘膦(Glyphosate)是一種典型的廣譜性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型滅生性除草劑，是雜草控制的首選除草劑。本研究將具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦除草劑基因(EPSPS-G6)構(gòu)建進(jìn)植物表達(dá)載

2、體，用農(nóng)桿菌活體轉(zhuǎn)化方法將目的基因轉(zhuǎn)入陸地棉推廣品種中棉所49，創(chuàng)制高抗草甘膦棉花種質(zhì)系，分析其抗性表現(xiàn)及相關(guān)農(nóng)藝性狀，探討其生產(chǎn)應(yīng)用前景。主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSPS-G6，酶切獲得目的基因EPSPS-G6，并與空載體pCAMBIA2301連接構(gòu)建棉花高效表達(dá)載體——pCAMBIA2301-EPSPS-G6，去除原載體中的NPII篩選標(biāo)記基因，將目的基因作為篩選標(biāo)記。<

3、br>　　2、對(duì)本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制的農(nóng)桿菌活體轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，含50mg/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的轉(zhuǎn)化液可將陽性率提高至22.18％，是對(duì)照(9.72％)的2.28倍。此外，不同轉(zhuǎn)化時(shí)間轉(zhuǎn)化效率差異顯著，其中開花當(dāng)天中午12:00～14:00轉(zhuǎn)化得到陽性率最高(22.18％)，下午13:00～15:00次之(18.86％)，上午8:00～10:00轉(zhuǎn)化效率最低(11.29％)。
　　3、采用優(yōu)化的

4、農(nóng)桿菌活體轉(zhuǎn)化方法，將EPSPS-G6基因?qū)氲疥懙孛尥茝V品種——中棉所49，共收獲轉(zhuǎn)化種子14.3 kg，T0轉(zhuǎn)化植株經(jīng)20 mM草甘膦噴施，陽性率達(dá)22.18％。經(jīng)PCR驗(yàn)證，共獲得了35株含EPSPS-G6基且抗草甘膦的T0轉(zhuǎn)基因植株。
　　4、T1轉(zhuǎn)基因后代的抗性分離比例從1/4～3/4不等。對(duì)T1陽性植株進(jìn)行自交，按單株收獲，T2抗性穩(wěn)定材料占19.8～32.1％，基本符合一對(duì)雜合基因分離的規(guī)律。
　　5、田間草甘

5、膦抗性水平和莽草酸含量結(jié)果表明，轉(zhuǎn)EPSPS-G6基因棉花種質(zhì)系可抗3倍以上的推薦濃度，其抗性水平明顯優(yōu)于美國抗草甘膦品種和本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制的第一代抗草甘膦棉花種質(zhì)系，其中EPSPSG6-501種質(zhì)系抗草甘膦的能力最強(qiáng)。
　　6、轉(zhuǎn)EPSPS-G6基因棉花種質(zhì)系籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量、衣分均與中棉所49近似;鈴重、籽指略高于對(duì)照;株高與對(duì)照近似;果枝數(shù)略低于對(duì)照;單株鈴數(shù)與對(duì)照一致。纖維品質(zhì)檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)EPSPS-G6基因棉花種質(zhì)系的

6、纖維長度和整齊度略優(yōu)于對(duì)照;馬克隆值與對(duì)照在同一品級(jí)且略好于對(duì)照;伸長率略低于對(duì)照;斷裂比強(qiáng)度與對(duì)照相同。說明外源基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因棉花種質(zhì)系的產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)無明顯影響。
　　7、調(diào)查了金華地區(qū)的雜草發(fā)生情況與防控成本，為抗草甘膦棉花品種的應(yīng)用提供依據(jù)。結(jié)果表明，金華地區(qū)棉田雜草以牛筋草、馬齒莧和小飛蓬為主，化學(xué)除草可節(jié)省植棉除草用工開支約1000元/畝，抗草甘膦棉花品種的生產(chǎn)應(yīng)用可取得顯著的經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用前景