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文檔簡介
1、目的:
神經(jīng)管畸形是一種嚴重的神經(jīng)管缺陷性畸形,在世界范圍內(nèi)的發(fā)生率為0.5‰-20‰,目前還沒有有效的治療方式。近幾年采用的脊柱裂修補術(shù)雖然能夠減輕繼發(fā)性腦積水和改善部分下肢功能,但是對修復(fù)下肢感覺障礙,運動障礙及自主神經(jīng)功能障礙,例如膀胱、肛門等括約肌功能障礙導(dǎo)致的尿、便失禁等術(shù)后神經(jīng)損傷的后遺癥仍無良好效果,這是由于神經(jīng)受損后的極難修復(fù)所造成的。因此,我們課題組提出在胚胎發(fā)育早期針對神經(jīng)管畸形的神經(jīng)發(fā)育不良而進行神經(jīng)元的
2、修復(fù)重建是提高手術(shù)治療效果的關(guān)鍵,這樣既可以治療神經(jīng)源性發(fā)育異常,又可以避免繼發(fā)性損傷。
骨髓間充質(zhì)干細胞是一種成體干細胞,具有自我增殖和分化為多種細胞的潛能,尤其是能夠分化為神經(jīng)細胞,移植后的MSCs表現(xiàn)出了較好的神經(jīng)修復(fù)潛能,可在體外培養(yǎng)、擴增和誘導(dǎo)分化。
已有研究表明,肝細胞生長因子在MSCs治療多發(fā)性硬化癥、肝硬化、骨不連、腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷等疾病的治療中起著重要作用,尤其是在多發(fā)性硬化癥及肝纖維化
3、的治療中更為重要。
我們課題組在前期研究的基礎(chǔ)上,利用骨髓MSCs羊膜腔內(nèi)移植來治療早期神經(jīng)管畸形,證實了在神經(jīng)管畸形早期,羊膜腔內(nèi)注射的骨髓MSCs可以自主向胚胎神經(jīng)管畸形缺損部位特異性遷移并存活,并且發(fā)現(xiàn)MSCs自主遷移可能與神經(jīng)管畸形胚胎的體內(nèi)微環(huán)境及趨化因子有關(guān),本研究旨在探究骨髓MSCs移植后的遷移與Hgf/Met通路的關(guān)系,為探究細胞因子與骨髓MSCs遷移的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)和實驗方法,為骨髓MSCs在神經(jīng)管畸形胚胎
4、中的早期治療提供基礎(chǔ)。
研究方法:
1、骨髓MSCs分離培養(yǎng)
選取適齡的Wistar大鼠,體重在60g到100g,在無菌條件下取出大鼠股骨,用5ml增殖培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)(含10%胎牛血清)沖洗骨髓腔,適當吹打,做成細胞懸液,采用貼壁法分離骨髓MSCs,5%CO2,37℃孵箱中進行細胞培養(yǎng)。
綠色熒光蛋白標記骨髓MSCs,轉(zhuǎn)染腺病毒-5F35-enhanced Gene Fluore
5、scentProtein(eGFP),繼續(xù)培養(yǎng)24h,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況,細胞計數(shù)板計數(shù)GFP陽性細胞數(shù)及轉(zhuǎn)染率,消化,吹打,離心后制成3000-5000個/ul的細胞懸液。
2、動物模型建立與羊膜腔內(nèi)MSCs注射
成年Wistar大鼠雌雄比例5∶1午夜合籠,次日晨8:00左右進行陰道涂片,普通顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子即視為受孕,記為懷孕第0天(E0),于孕鼠懷孕第9.5(E9.5)天或第10天(E10
6、)時對孕鼠進行深度麻醉下剖腹取出子宮,在體式顯微鏡下分離胚胎,注意不要破壞卵黃囊膜和胎盤,進行體外培養(yǎng),用DMSO溶解的全反式維甲酸致畸,隨機將來自同一只孕鼠的胚胎分為正常對照組和3μM全反式維甲酸處理組,在不同O2濃度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24h,棄掉DMSO溶解的全反式維甲酸,立即換上新鮮培養(yǎng)基。于48h后終止培養(yǎng),取出胚胎,4%多聚甲醛固定。
在體外培養(yǎng)的不同時間點(E9.5,E10,E10+12h,E10+24h)進行羊膜腔內(nèi)注射
7、移植MSCs,使用顯微注射針在胚胎背側(cè)進入羊膜腔,注意避開卵黃囊血管發(fā)生部位,將0.2μl MSCs懸液或者單純培養(yǎng)基注射到胚胎的羊膜腔內(nèi),注畢觀察羊膜腔是否充盈,如果充盈則視為成功,繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng)至48h。
使用體式熒光顯微鏡觀察骨髓MSCs的定植情況并且立即采集圖像,分析骨髓MSCs的趨化規(guī)律。結(jié)束培養(yǎng)后的胚胎使用4%的多聚甲醛固定后進行冰凍切片,放于-80℃冰箱中保存。
3、組織切片、細胞計數(shù)與免疫熒光染色<
8、br> 冰凍切片:將胚胎從-80℃冰箱中取出,立即用OCT包埋,使用冰凍切片機取橫斷面連續(xù)切片,片厚20μm,在熒光顯微鏡下觀察,選取有綠色熒光蛋白表達的玻片,-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 細胞計數(shù):將上述玻片于熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光細胞個數(shù)。
免疫熒光染色:將上述冰凍切片經(jīng)甲醇二次固定,抗原熱修復(fù),10%血清封閉,加一抗4℃過夜,加488或羅丹明標記的熒光二抗,DAPI染核。鏡下觀察。
4、熒光定量PCR檢測不
9、同時間點移植MSCs后Hgf/Met的表達情況
選取經(jīng)體外培養(yǎng)48h的正常組和露腦畸形組胚胎,每組12例,提取胚胎中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,應(yīng)用合適的引物序列,配制反應(yīng)體系,用ABI7500熒光定量PCR儀進行PCR反應(yīng),最后采用2-△△ct法分析目的基因mRNA相對表達量變化。檢測正常組和露腦畸形組Hgf/Met的表達情況。
5、統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用Graphpad prism5軟
10、件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗和單因素方差分析,以P值表示統(tǒng)計差異,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1、維甲酸體外誘導(dǎo)大鼠胚胎發(fā)生神經(jīng)管畸形
利用濃度為3μM的全反式維甲酸對體外培養(yǎng)的大鼠胚胎進行誘導(dǎo)致畸,成功誘導(dǎo)胎鼠出現(xiàn)顯性脊柱裂和露腦畸形等表型的神經(jīng)管畸形。
2、不同時間點移植的MSCs在胎鼠中的定植率
胚胎羊膜腔內(nèi)注射MSCs,在體外培養(yǎng)至48h后,利用熒光顯微鏡可以觀察到骨髓
11、MSCs在正常組胚胎和神經(jīng)管畸形組胚胎中都有存活。其中,在正常組胚胎中,MSCs主要在閉合完全的中后腦背部神經(jīng)管處存活,而在畸形胚胎中,MSCs主要定植部位在神經(jīng)管畸形的發(fā)生部位和中后腦背部神經(jīng)管。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),MSCs在胚胎中的定植率隨著畸形程度的加重而增多。在本研究中,我們觀察了不同時間點注射移植對骨髓MSCs定植率的影響,結(jié)果表明,E9.5、E10在正常組和畸形組移植細胞的定植率較高,而E10+12h、E10+24h移植M
12、SCs的定植率明顯降低。
3、免疫熒光染色結(jié)果
細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示在MSCs染色中可以看出,體外培養(yǎng)的MSCs中高表達HGF,不表達MET。組織免疫熒光染色顯示在胚胎中,脊髓部位高表達MET,而不表達HGF。
4、熒光定量PCR檢測不同時間點移植MSCs后Hgf/Met的表達情況
定量PCR檢測顯示:與正常組相比,Hgf在E10時的mRNA表達水平在NTDs胚胎中升高6.636倍,(P<0.
13、01),E10+12h時的表達量在NTDs胚胎中升高2.99倍(P<0.01),E10+24h時的表達量在NTDs胚胎中升高2.04倍(P<0.01),在E10+48h時Hgf在畸形胚胎中的表達無差異。
與正常組相比,畸形組Met在E10時的mRNA表達水平在NTDs胚胎中升高2.35倍,(P<0.05),E10+12h時的表達量在NTDs胚胎中升高1.63倍(P<0.05),在E10+24h,E10+48h時Met在畸形胚胎
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