人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、鑒定以及干細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子誘導其重編程的研究.pdf

1、背景：誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的出現(xiàn)不僅為人體組織工程繞開了胚胎干細胞的倫理障礙,而且為干細胞的研究提供了一種新思路新材料。然而,目前iPSC技術(shù)尚不成熟,高額的費用和極低的誘導成功率嚴重制約了iPSC的發(fā)展,因此尋求一種既經(jīng)濟又高效的誘導方法是目前亟待解決的科學難題。
　　 間充質(zhì)干細胞(mesnchymal stem cells,MSCs)是體細胞分化較低的幾類細

2、胞之一,因其橫向分化能力使其在成體干細胞的研究領(lǐng)域中備受矚目。相比其他成體細胞,MSCs具有更強的可塑性,因此本課題使用已有的逆轉(zhuǎn)錄病毒可能更容易將其誘導成為多能干細胞。
　　 腺病毒載體(adenovirus vector)是一種具有高效轉(zhuǎn)染能力的基因載體,因其容量大、產(chǎn)量高、毒副作用小等優(yōu)點被廣泛應用于基因治療。本課題初步探索利用腺病毒載體攜帶Oct4、Sox2、K1f4、Nanog四個轉(zhuǎn)錄因子,能否誘導臍帶間充質(zhì)干細胞進行

3、重編程,探索一條高效、經(jīng)濟的iPSC誘導方法,為臨床應用和細胞治療奠定基礎(chǔ)。
　　 實驗內(nèi)容:1)由人臍帶中分離出間充質(zhì)干細胞(UCMSCs),于體外培養(yǎng)并鑒定。2)利用已有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對其進行iPSC的誘導,并鑒定其相關(guān)指標。3)構(gòu)建嵌合型腺病毒載體Ad5/F11b,且攜帶Oct4、Sox2、K1f4、Nanog四個轉(zhuǎn)錄因子基因。4)利用構(gòu)建好的攜帶轉(zhuǎn)錄因子基因的嵌合型腺病毒Ad5/F11b感染UCMSCs,并嘗試誘導出多能

4、干細胞。
　　 實驗結(jié)果:1)從人臍帶中分離出間質(zhì)樣細胞,經(jīng)細胞周期、表面標記、分化潛能等指標確定其為間充質(zhì)干細胞。2)已有的逆轉(zhuǎn)錄病毒可成功將所分離的臍帶間充質(zhì)干細胞誘導為人胚胎干細胞(hESCs)樣克隆團細胞,檢測發(fā)現(xiàn)在mRNA水平上4個轉(zhuǎn)錄因子均不同程度的上調(diào)表達,且與hESCs相關(guān)基因的表達水平也明顯提高。可進一步檢測其生化指標確定是否為iPSC。3)構(gòu)建攜帶Oct4、Sox2、K1f4、Nanog四個轉(zhuǎn)錄因子基因的嵌合

5、型腺病骨架質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定確定為正確克隆,并于HEK293細胞中包裝出病毒。4)利用攜帶4個轉(zhuǎn)錄因子的嵌合型腺病毒感染UCMSCs,出現(xiàn)類似hESCs的克隆團細胞,還需進一步證實iPSC的誘導情況。
　　 結(jié)論:1)成功于人臍帶中分離出間充質(zhì)干細胞,并通過逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導成hESCs樣克隆團細胞,該細胞與hESCs相關(guān)的4個轉(zhuǎn)錄因子均不同程度的上調(diào)表達,表現(xiàn)出類似hESCs特征。2)成功構(gòu)建攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nan