可高效降解雌激素的惡臭假單胞菌SJTE-1降解性質(zhì)與蛋白組學(xué)研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物污染，尤其是環(huán)境雌激素類污染物（Environmental Estrogens）污染，因其對(duì)人類健康的影響最廣，危害最大，被認(rèn)為是繼“溫室效應(yīng)”和“臭氧層破壞”之后的又一嚴(yán)重的全球性環(huán)境公害問題。因其種類多，分布廣，難降解，環(huán)境存留期長(zhǎng)，且會(huì)通過食物鏈逐級(jí)累積放大，具有很強(qiáng)的致癌、致畸與致病性，直接威脅著人類社會(huì)與生物圈的生存與繁衍。17β-雌二醇作為天然雌激素類污染物的主要成員，對(duì)生物體具有很大的危害。因此如何治理環(huán)境

2、中雌激素物質(zhì)的污染、降低其危害已被列為環(huán)境治理與預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。近年來，微生物降解因其降解效率高和無二次污染等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是去除環(huán)境雌激素的主要與有效手段。從環(huán)境中分離獲得的微生物菌株或菌群，可利用雌激素類物質(zhì)作為碳源或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)過復(fù)雜的生理代謝，最終將其完全分解為無害的終產(chǎn)物。目前已有多種菌株被證實(shí)具有雌激素降解能力，但是由于降解效率不理想，遺傳背景不確定，基因組信息缺乏，代謝機(jī)制不清晰，直接限制了微生物修復(fù)雌激素污染的進(jìn)程

3、。
　　本課題圍繞我們從污水處理廠活性污泥中富集分離的一株可利用雌激素類物質(zhì)的微生物菌株SJTE-1開展，從其理化性質(zhì)與進(jìn)化地位、雌激素降解利用效能、全基因組序列與比較蛋白組學(xué)幾個(gè)方面進(jìn)行了研究：確定了菌株 SJTE-1的進(jìn)化地位，檢測(cè)了其利用17β-雌二醇（E2）生長(zhǎng)的性質(zhì)及其降解效能；利用GLX-454平臺(tái)和Illuminia測(cè)序平臺(tái)，測(cè)定了該菌株的全基因組序列并進(jìn)行了比對(duì)分析，預(yù)測(cè)了一系列可能參與雌激素降解的基因；利用同位素

4、相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ技術(shù)），測(cè)定了菌株SJTE-1在17β-雌二醇環(huán)境下和營(yíng)養(yǎng)豐富條件下的蛋白組學(xué)，并進(jìn)行了比較與分析。最后，利用Tn轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)，對(duì)該菌株進(jìn)行了隨機(jī)突變與篩選。主要內(nèi)容如下：
　　1.菌株SJTE-1的分離鑒定與雌激素降解效能分析
　　利用17β-雌二醇富集培養(yǎng)分離獲得的菌株SJTE-1，理化性質(zhì)分析顯示其為革蘭氏陰性菌，菌落質(zhì)地柔軟，扁平，乳白色，半透明，表面光滑而有光澤度，邊緣呈圓形，且

5、散發(fā)出濃烈的腥臭味；最適生長(zhǎng)溫度為30?C。16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，菌株SJTE-1與假單胞菌屬（Pseudomonas）的16S rRNA基因序列具有極高的同源性與相似性（>99％）；系統(tǒng)進(jìn)化樹比對(duì)結(jié)果證實(shí)其與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的遺傳距離最近，為惡臭假單胞菌。
　　利用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀，對(duì)菌株SJTE-1以不同濃度的17β-雌二醇為單一碳源生長(zhǎng)的情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。生長(zhǎng)曲線結(jié)

6、果顯示，菌株SJTE-1可耐受和利用高達(dá)100 mg/L的17β-雌二醇，其生物量與雌激素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，雌激素濃度增加會(huì)延長(zhǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)的平臺(tái)期。之后，我們利用超高效液相色譜技術(shù)測(cè)定了菌株降解不同濃度雌二醇的降解效率，結(jié)果表明24小時(shí)內(nèi)菌株SJTE-1可將1 mg/L的17β-雌二醇完全降解；七天內(nèi)該菌株可完全分解高達(dá)25.0 mg/L的E2，對(duì)100 mg/L的17β-雌二醇降解效率也可達(dá)80%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報(bào)道的其它菌株的效能。進(jìn)一

7、步對(duì)其代謝產(chǎn)物的分析顯示，17β-雌二醇首先被菌株SJTE-1分解成為雌酮（E1）后，再被其降解為無雌激素活性的終產(chǎn)物。因此，菌株SJTE-1具有很高的雌激素降解效能與雌激素耐受性，降解周期短，降解產(chǎn)物無二次污染，可作為環(huán)境生物修復(fù)的候選菌株。
　　2.惡臭假單胞菌SJTE-1全基因組序列測(cè)定與分析
　　利用GLX-454平臺(tái)和Illuminia測(cè)序平臺(tái)，我們測(cè)定并分析了惡臭假單胞菌SJTE-1的全基因組序列。菌株SJTE-

8、1的基因組總長(zhǎng)5,551,505 bp，GC含量為62.25%，含有4,915個(gè)編碼基因，1個(gè)16S-23S-5S操縱子，52個(gè) tRNA；其編碼的蛋白功能涉及到各個(gè)代謝途徑，包括跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，脅迫反應(yīng)，核酸代謝，蛋白代謝，芳香族化合物代謝，輔因子等。序列比對(duì)與預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，菌株SJTE-1的基因組中包含多個(gè)可能編碼激素分解酶的同源基因，包括短鏈脫氫/還原酶，乙酰輔酶A脫氫酶，烯酰基-酰載體蛋白還原酶，3-氧酰基-?；d體蛋白還原酶等，這些

9、基因可能與雌二醇的降解直接相關(guān)。因此，全基因組序列的測(cè)定與分析的完成明確了菌株 SJTE-1的遺傳信息，將有助于推進(jìn)其降解基因與降解機(jī)制研究。
　　3.惡臭假單胞菌SJTE-1比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　蛋白質(zhì)組學(xué)通過測(cè)定不同條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)水平，可確定細(xì)胞整體的代謝機(jī)制變化。在惡臭假單胞菌SJTE-1的全基因組序列測(cè)定完成后，利用iTRAQ技術(shù)，我們對(duì)菌株SJTE-1在17β-雌二醇為單一碳源培養(yǎng)條件下的整體蛋白表達(dá)情況

10、進(jìn)行了定性與定量分析，并與其在葡糖糖培養(yǎng)條件下的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在17β-雌二醇培養(yǎng)條件下，有78個(gè)蛋白表現(xiàn)出有顯著差異（p<0.05），其中45個(gè)蛋白明顯上調(diào)，33個(gè)蛋白發(fā)生了明顯下調(diào)。這些差異表達(dá)蛋白涉及脅迫回應(yīng)，碳源攝取，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，能量代謝，核酸代謝及轉(zhuǎn)錄翻譯等過程。表達(dá)上調(diào)的蛋白多集中在對(duì)碳源的攝取與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，相關(guān)核糖體蛋白的表達(dá)及能量代謝相關(guān)蛋白；而表達(dá)下調(diào)的蛋白多與葡萄糖識(shí)別及其代謝相關(guān)。這說明菌株SJTE

11、-1在以17β-雌二醇為碳源生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)相應(yīng)提高與之相關(guān)的代謝途徑及能量需求。因此，這一比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果初步明晰了菌株SJTE-1代謝雌激素的整體網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)降解關(guān)鍵基因與調(diào)控基因的鑒定指明了方向。
　　4. Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變
　　為了確定參與雌激素降解的基因，我們利用Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變方法對(duì)惡臭假單胞菌SJTE-1進(jìn)行突變，根據(jù)其雌激素降解效能缺失與抗生素抗性情況進(jìn)行篩選。共篩選獲得了56株突變株，它們可在豐富培養(yǎng)基

12、中正常生長(zhǎng)，但不能在以雌二醇為單一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說明這些突變株的雌二醇降解能力受影響，Tn5插入的基因可能是參與雌二醇分解的關(guān)鍵基因。但對(duì)Tn5插入位點(diǎn)的反向測(cè)序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有效的基因信息，即其序列與已報(bào)道的雌激素降解基因或組學(xué)方法預(yù)測(cè)的潛在降解基因之間無重疊。后續(xù)我們將對(duì)突變株進(jìn)行全基因組掃描來確定其Tn插入位點(diǎn)，最終確定菌株SJTE-1中雌激素降解的關(guān)鍵基因。
　　綜上所述，本課題富集分離了一株新的具有實(shí)際應(yīng)用潛能的

13、環(huán)境雌激素降解菌株SJTE-1，利用分子生物學(xué)技術(shù)和組學(xué)技術(shù)，對(duì)其降解效能、全基因組學(xué)和比較蛋白組學(xué)進(jìn)行了研究，并對(duì)其降解分子機(jī)制進(jìn)行了初探。結(jié)果顯示惡臭假單胞菌SJTE-1可耐受高濃度雌二醇，降解效率高，降解周期短；其基因組中包含了多個(gè)潛在的雌激素降解基因，在雌二醇為單一碳源環(huán)境下，菌株SJTE-1胞內(nèi)的多個(gè)涉及到脅迫回應(yīng)，碳源攝取，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，能量代謝，核酸代謝及轉(zhuǎn)錄翻譯等過程的蛋白的表達(dá)水平均發(fā)生了顯著性變化。本課題的完成將有助于推