RGC‐32在急性腎損傷腎小管修復中的作用及可能機制.pdf

1、急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）為臨床常見危重癥，指多種原因引起的腎小球濾過率（Glomerular Filtration Rate，GFR）突然下降，臨床表現(xiàn)為氮質(zhì)血癥、水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及全身各系統(tǒng)癥狀。盡管人類對AKI的診斷治療水平尤其是腎臟替代技術(shù)有了長足進步，但AKI死亡率仍高達5％‐10%，伴腎外器官衰竭患者可達50%‐70%。此外，AKI是引發(fā)慢性腎功能不全常見原因之一。急慢性腎損傷已經(jīng)成

2、為威脅人類健康的重要疾病。因此，積極尋找AKI發(fā)生及發(fā)展機制，對AKI進行早期診斷及治療一直是全球腎臟病研究者的熱門課題。
　　腎臟急性缺血缺氧再灌注損傷（Acute Ischemia‐reperfusion Kidney Injury，AIKI）是臨床最常見的AKI病因之一，其主要病理特征為急性腎小管壞死。研究表明，急性腎小管壞死發(fā)生后細胞周期循環(huán)在腎小管修復過程中起著極其重要的作用。業(yè)已證明，補體應(yīng)答基因‐32（Respons

3、e Gene to Complement32，RGC‐32）為細胞周期關(guān)鍵調(diào)控分子，促進細胞周期循環(huán)參與細胞增生。本研究第一部分在建立 AIKI動物模型基礎(chǔ)上，通過實時熒光定量PCR、Western blotting以及免疫組織化學等方法觀察了RGC‐32在AIKI大鼠腎組織中的動態(tài)表達變化及分布，并初步了解其在AIKI大鼠腎組織中的表達規(guī)律及其意義。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎缺血再灌注損傷24h后，RGC‐32在腎組織表達水平出現(xiàn)明顯下調(diào)并持續(xù)

4、至缺血再灌注后72h，術(shù)后1周其表達量逐漸上升至基本正常水平，提示RGC‐32可能在急性腎損傷過程中發(fā)揮作用。隨后，為明確RGC‐32在大鼠AIKI過程中的可能機制，本研究第二部分通過體外腎小管上皮細胞損傷模型，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)干預(yù)RGC‐32表達，進一步觀察了RGC‐32對腎小管上皮細胞損傷及修復的影響。
　　第一部分：RGC‐32在急性腎損傷大鼠腎組織中的表達及意義
　　【目的】：
　　通過建立大鼠AIKI模型，觀

5、察RGC‐32在AIKI大鼠腎組織中表達變化與分布規(guī)律，了解RGC‐32在AIKI中的意義。
　　【方法】：
　　采用國際公認的雙側(cè)腎蒂夾閉法建立AIKI模型，SD大鼠隨機分組：
　?。?）模型組（AIKI組）（n=64）：分離大鼠雙側(cè)腎蒂，持續(xù)阻斷45min。并分別于腎臟缺血再灌注后2h、6h、24h、48h、72h、1w、2w、4w分別處死大鼠8只。通過腹主動脈采血檢測血清肌酐（Serum Creatinine，S

6、cr）水平。留取腎臟組織，通過實時熒光定量PCR、Western blotting以及免疫組織化學法明確腎組織損傷程度及RGC‐32表達變化與分布規(guī)律。
　?。?）假手術(shù)組（sham組）（n=64）：僅分離雙側(cè)腎蒂而不進行腎蒂阻斷，其余操作同AIKI組。
　　【結(jié)果】：
　?。?）通過免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)：正常大鼠腎組織中RGC‐32主要表達于近端小管、遠端小管及集合管上皮細胞，腎小球僅有微弱表達；RGC‐32在腎小管

7、間質(zhì)及腎臟血管無表達。
　?。?）AIKI組缺血再灌注后2h、6h、24h、48h、72h、1w、2w、4w RGC‐32蛋白相對表達水平分別為0.0168±0.0029,0.0156±0.0021,0.0065±0.0013,0.0075±0.0013,0.0096±0.0014,0.0132±0.0016,0.0169±0.0014,0.0179±0.0022。其中缺血再灌注后24h、48h、72h兩組間RGC‐32蛋白表達水

8、平差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。RGC‐32 mRNA表達水平變化與免疫組化結(jié)果相符。RGC‐32蛋白表達與腎小管‐間質(zhì)損傷評分存在顯著負相關(guān)（r=‐0.514，P<0.01）。
　　【結(jié)論】：
　　（1）首次發(fā)現(xiàn) RGC‐32蛋白在正常SD大鼠腎組織中主要表達于腎小管上皮細胞胞漿，腎小球系膜細胞可有微弱表達，腎血管及腎小管間質(zhì)無表達。
　　（2）大鼠腎臟缺血再灌注后，RGC‐32于再灌注后24h‐72h表達

9、水平明顯降低。RGC‐32可能在AKI發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分：RGC‐32通過細胞周期參與腎小管上皮細胞損傷及修復過程
　　【目的】：
　　通過體外腎小管損傷模型，研究 RGC‐32對腎小管上皮細胞周期影響以及參與腎小管上皮細胞損傷修復過程的作用。
　　【方法】：
　　（1）體外培養(yǎng) NRK‐52E細胞，TNF‐α（10ng/ml）干預(yù)制備體外腎小管上皮細胞損傷模型并鑒定。
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10、2）采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)分別轉(zhuǎn)染RGC‐32真核表達載體和RGC‐32 siRNA，制備RGC‐32高表達組及RGC‐32敲低組，驗證轉(zhuǎn)染效果。
　?。?）通過流式細胞儀，檢測RGC‐32高表達組及RGC‐32敲低組細胞周期變化。
　?。?）Western blotting方法檢測各組細胞損傷標志物及細胞外基質(zhì)表達。
　　【結(jié)果】：
　?。?）與對照組相比，RGC‐32敲低組G2/M期比例明顯增多（P<0.05）；R