鯉魚腸道sglt1的表達與抗體制備.pdf

1、以鯉魚(Cyprinus carpio)為研究對象,采用RT-PCR、SDS-PAGE電泳、ELISA等分子生物學及免疫學技術,對鯉魚腸道鈉/葡萄糖共轉運載體1(sglt1)基因的克隆、表達及Sglt1抗體制備進行了研究?？寺×藄glt1全長cDNA;表達了由sglt1基因編碼、長度為92個氨基酸且具有一個抗原決定簇的多肽;以純化的多肽為抗原,通過免疫新西蘭長耳兔,成功獲得了具有較高效價的Sglt1抗體。
　　 1、具有抗原決定

2、簇多肽的表達。從鯉魚腸道中克隆了sglt1基因編碼區(qū)全長序列,選用pET-32a(+)Vector作為表達載體,設計限制性酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ,將編碼92個氨基酸、具有Sglt1抗原決定簇的核苷酸片段連接至pET-32a(+)上,經篩選獲得陽性重組子pET-32a(+)-sglt1(抗原決定簇片段);將陽性重組子轉化至E.coliRosetta中,獲得重組因工程菌。通過IPTG誘導表達,獲得目標多肽。SDS-PAGE電泳分析表

3、明,目標多肽分子量約為30kDa。
　　 2、Sglt1抗體制備。以獲得的多肽為抗原,與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混合,采用耳緣靜脈結合皮下注射,免疫新西蘭長耳兔4次,免疫總時長為38d。成功制備了鯉魚Sglt1抗體,ELISA測得效價為1:105。通過免疫組織化學,驗證了抗體的使用效果。結果表明,本研究制備的抗體可以成功應用于鯉魚Sglt1的表達定位研究。
　　 本研究制備的Sglt1多克隆抗體是重要的研究工具,為鯉