雞恒定鏈基因的克隆、表達(dá)及其抗體制備.pdf

1、該研究根據(jù)GenBank中登錄的雞Ii基因序列和載體pcDNA3的多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對引物,利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)從經(jīng)過有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激16h活化的雞脾淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出大小約為672bp的基因;經(jīng)單酶切鑒定,與已知的雞Ii基因含有相同的Pst Ⅰ酶切位點(diǎn).將其克隆到載體pcDNA3中,并轉(zhuǎn)化宿主菌DH5 α,雙酶切方法鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3-Ii.進(jìn)一步測定重組質(zhì)粒pcDNA3-Ii中雞I

2、i基因的核苷酸序列,結(jié)果表明該基因完整開放閱讀框架(Open reading frame,ORF)由672個(gè)核苷酸組成,編碼223個(gè)氨基酸,與已知雞Ii基因序列相比有98％的同源性,證明該實(shí)驗(yàn)成功的克隆到雞Ii基因.根據(jù)所克隆的雞Ii基因序列和原核表達(dá)載體PGEX-4T-1多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)另一對引物,應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pcDNA3-Ii中擴(kuò)增出含有完整ORF的雞Ii基因.再將擴(kuò)增的雞Ii基因克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-1中

3、,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒PGEX-4T-l-Ii,并進(jìn)行雙酶切鑒定.然后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h,表達(dá)出谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與Ii的融合蛋白GST-Ii.通過優(yōu)化原核表達(dá)條件,確定了原核表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度.對表達(dá)蛋白的可溶性進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物GST-Ii融合蛋白以包涵體形式存在.我們用優(yōu)化的原核表達(dá)條件對含有PGEX-4T-1-Ii質(zhì)粒的

4、BL21菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),反復(fù)凍融和超聲方法裂解誘導(dǎo)菌,獲得濃度較高的GST-Ii包涵體蛋白,用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解,溶解的包涵體通過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析獲得純化的GST-Ii融合蛋白.利用純化的GST-Ii融合蛋白作為抗原分別免疫家兔和小鼠制備兔抗雞Ii多克隆抗體和鼠抗雞Ii多克隆抗體.瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)表明制備的兩種多抗均具有良好的反應(yīng)性,ELISA實(shí)驗(yàn)表明兔多抗和鼠多抗的有效稀釋度分別可達(dá)1:25600和l