RegⅣ抗體制備及組織表達(dá)譜與應(yīng)用研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。在我國由于結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷攀升，對其發(fā)生機(jī)制的研究已經(jīng)引起人們的極大重視。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是基因改變不斷發(fā)生、不斷累積的結(jié)果。研究顯示，腺瘤是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期階段，多數(shù)結(jié)直腸癌是從腺瘤癌變而來的。切除腺瘤可以有效地降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率。然而，約30％～46％的腺瘤患者在接受治療后2.5～7年內(nèi)會復(fù)發(fā)。目前尚缺乏有效的指標(biāo)來預(yù)測腺瘤的進(jìn)一步演進(jìn)或復(fù)發(fā)。因此，腺瘤的發(fā)生機(jī)制及其進(jìn)展為癌的機(jī)制

2、的研究對于結(jié)直腸癌的預(yù)防及治療具有重大意義。盡管結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)理相對于其它實(shí)體腫瘤的研究較為深入，但細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變是一個極其復(fù)雜的、多步驟過程，許多細(xì)節(jié)至今還不清楚。除了少數(shù)已知基因外，許多未知基因也參與了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過程，其在轉(zhuǎn)變過程中的作用還有待進(jìn)一步鑒定。因此，結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)差異表達(dá)基因的識別、分離和鑒定，結(jié)直腸癌發(fā)生不同階段轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵基因的確定，將為結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌發(fā)生的機(jī)理的深入了解奠定基礎(chǔ)，同

3、時，為早期診斷和治療提供依據(jù)。 1999年，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用抑制性差減雜交法(SSH)(利用一個同時患有結(jié)腸腺瘤和腺癌的病例)構(gòu)建了三個cDNA差減文庫，分別為：腺瘤相對于正常粘膜的差異片段文庫(A—N)、腺癌相對于腺瘤的差異片段文庫(T—A)、腺癌相對于正常粘膜的差異片段文庫(T—N)．在分析A—N文庫時，我們發(fā)現(xiàn)RegⅣ是在腺瘤中相對高表達(dá)的基因。 Reg基因家族，即再生基因(RegeneratingGene)家族，屬于

4、C型植物血凝素超家族。該基因家族成員，均為小分子量的分泌性蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)上具有相似的鈣離子依賴性血凝素結(jié)構(gòu)域。它們具有急性期反應(yīng)蛋白，凝集素，及抗凋亡或生長因子樣的作用，參與炎癥，損傷/修復(fù)過程，并與糖尿病及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與人類相關(guān)的Reg基因家族成員一共有4個，即RegⅠα，RegⅠβ，RegⅢ及RegⅣ。RegⅣ又稱為再生蛋白樣蛋白(regeneratingprotein—likeprotein，REL

5、P)，或胃腸分泌蛋白(gastrointesinalprotein，GISP)，是2001年從炎癥性腸病中篩選出來的新基因，屬于最新一類Reg基因家族成員。不久之后，我們便從A—N文庫中，篩選到RegⅣ在腺瘤中高表達(dá)。與其他人類Reg家族成員不同的是，RegⅣ定位于第一號染色體上，而其余成員均定位于第二號染色體。但RegⅣ與Reg基因家族的其他成員在結(jié)構(gòu)及功能上具有相似性。近年來的研究顯示，RegⅣ與胃、結(jié)直腸及胰腺腫瘤相關(guān)，并可在前列

6、腺癌中高表達(dá)。Violette等發(fā)現(xiàn)相對于藥物敏感性細(xì)胞系，RegⅣ在耐藥性的結(jié)直腸細(xì)胞系中表達(dá)水平高。有關(guān)RegⅣ功能機(jī)制的研究只有一篇有關(guān)它參與EGFR/AKT/AP-1信號通路的報道。RegⅣ作為一個從結(jié)直腸腺瘤的cDNA文庫中篩選出來的高表達(dá)基因，該基因的編碼產(chǎn)物在結(jié)直腸組織中的定位及表達(dá)情況是未知的；作為一個在癌前病變中高表達(dá)的基因，RegⅣ是否可作為結(jié)直腸癌早期診斷工具是未知的；作為一個較新的基因，RegⅣ的表達(dá)譜從未有人做

7、詳盡的報道。 為更多地了解RegⅣ，并為深入研究RegⅣ在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供數(shù)據(jù)支持，本課題擬制備RegⅣ蛋白的多克隆抗體及單克隆抗體；研究RegⅣ基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況；利用自制抗體，通過免疫組化的方法，分析RegⅣ在全身各器官正常及病變組織中的表達(dá)譜，以期為其功能的闡釋及應(yīng)用前景的描述提供新的視角。 我們利用原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)RegⅣ全長重組蛋白，將其純化后與RegⅣ肽段蛋白同時免疫新西蘭大白兔，制備多克

8、隆抗體；用RegⅣ全長重組蛋白免疫BALB/c小鼠，與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞體外融合，通過篩選、克隆化稀釋及鑒定，獲得穩(wěn)定分泌RegⅣ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株．將自制的兔抗RegⅣ肽段多抗、自制兔抗RegⅣ重組蛋白多抗及商業(yè)化羊抗RegⅣ重組蛋白多抗的檢驗(yàn)效能進(jìn)行比較。利用自制兔抗RegⅣ重組蛋白多抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析RegⅣ在結(jié)直腸正常粘膜，腺瘤及癌配對組織中的表達(dá)定位情況，并用實(shí)時熒光定量PCR及Western—blot方法進(jìn)行

9、驗(yàn)證。我們通過對65例結(jié)直腸正常粘膜及匹配癌組織的免疫組化分析，研究RegⅣ的表達(dá)情況及其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。隨后，利用自制的單克隆抗體檢測全身24種正常器官組織及40種良惡性病變組織中RegⅣ的表達(dá)分布。另外，檢測18種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中RegⅣ的表達(dá)情況。 研究結(jié)果顯示我們制備的多克隆抗體及單克隆抗體，效價好，特異性強(qiáng)，可用于ELISA、Western—blot、及免疫組化檢測。相比于肽段蛋白作為抗原制備

10、的多抗，全長重組蛋白的多抗作為檢測工具更為可靠。免疫組化，Real—timePCR及Western—blot結(jié)果顯示RegⅣ在結(jié)直腸腺瘤中的表達(dá)顯著高于配對的正常粘膜與癌組織(p＜0.05)，而在正常粘膜與癌組織中的表達(dá)未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。RegⅣ在結(jié)直腸腺瘤中的陽性染色率為87.5％，在癌旁粘膜中為100％，而在癌組織中為30.8％。RegⅣ的表達(dá)與結(jié)直腸癌組織學(xué)類型(粘液腺癌/印戒細(xì)胞癌，8/11，72.7％，p=0.

11、004)及分化程度(低分化，7/11，63.6％，p=0.007)有關(guān)。在全身正常組織中，RegⅣ除較特異地表達(dá)于胃腸道外，還可在腎上腺與乳腺中被檢測到。在所有被檢惡性疾病組織中，RegⅣ傾向于在組織學(xué)類型為腺癌的惡性腫瘤中表達(dá)，其中在胰腺、胃、結(jié)腸、前列腺及肝臟轉(zhuǎn)移性腺癌中呈中度或強(qiáng)陽性表達(dá)，但是在肺腺癌中RegⅣ表達(dá)為陰性。在18種類型的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，RegⅣ主要表達(dá)于胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤包括胰腺、胃、結(jié)直腸及闌尾，很少見于胃腸

12、道外的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，除嗜鉻細(xì)胞瘤(大多為中強(qiáng)陽性染色)及甲狀腺髓樣癌(一般為弱陽性)。CgA與RegⅣ染色比較發(fā)現(xiàn)，CgA表達(dá)陰性的胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，RegⅣ可呈陽性表達(dá)。 通過以上研究，我們得出以下結(jié)論： 我們成功制備了RegⅣ的多克隆抗體及單克隆抗體，從而為RegⅣ表達(dá)譜及應(yīng)用前景的研究奠定了良好的基礎(chǔ)； RegⅣ在結(jié)直腸腺瘤中高表達(dá)，可能參與了結(jié)直腸癌早期階段的分子改變，而RegⅣ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

13、與低分化及粘液腺癌有關(guān)，說明其可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中有多重作用； 在正常組織中，RegⅣ的表達(dá)部位主要局限于消化系統(tǒng)；惡性病變中，RegⅣ富集表達(dá)于腺癌中，可見，RegⅣ的表達(dá)具有一定的組織特異性，它可能在腺上皮腫瘤尤其是消化系統(tǒng)腺上皮腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。另外，RegⅣ在結(jié)直腸腺癌及其他多種組織來源的腺癌中呈陽性表達(dá)而在肺腺癌中完全陰性表達(dá)，使其有可能成為一個鑒別轉(zhuǎn)移性腺癌原發(fā)灶為肺或肺外器官的輔助指標(biāo)；