辛伐他汀通過PPARγ抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:血栓形成是涉及臨床多種疾病的重要病理生理過程，在心血管疾病領(lǐng)域，特別是在動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，起著非常重要的作用，?？梢饑?yán)重危害人類健康的臨床綜合征。
　　因此，本研究通過探討辛伐他汀體外干預(yù)對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集粘附，對血小板活化標(biāo)志物表達(dá)、胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化、血小板胞漿cAMP水平、所涉及的PI3K/Akt及血小板MAPKs信號系統(tǒng)的影響，以及血小板胞漿PPARs活化對上述影響的作用，

2、力求從新的角度闡述他汀類藥物抗血小板活化的作用機(jī)制。
　　方法:本研究首先應(yīng)用全血阻抗法探討辛伐他汀對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的作用，并通過ELISA法檢測辛伐他汀對血小板PPARs活化的影響，隨后應(yīng)用全血阻抗法和激光共聚焦技術(shù)探討PPARs活化對辛伐他汀抑制血小板聚集及粘附的影響。此外，利用流式細(xì)胞術(shù)、分光光度法、ELISA法等進(jìn)一步證實辛伐他汀具有抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化的作用，同時PPARγ激活在辛伐他汀抑制血小板活化中發(fā)揮重要

3、作用。通過應(yīng)用蛋白免疫印跡、免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步探討辛伐他汀影響膠原誘導(dǎo)的血小板活化所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及PPARγ激活對相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的影響及作用方式。本研究旨在揭示辛伐他汀對膠原誘導(dǎo)的血小板活化的影響，及PPARs活化的作用，為了解辛伐他汀的抗血小板作用提供新的理論依據(jù)。
　　結(jié)果:我們的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀體外孵育血小板可激活PPARα及PPARγ，對PPARβ無明顯活化作用。同時，隨著藥物濃度升高，及孵育時間延長，辛伐

4、他汀可呈濃度和時間依賴性的抑制血小板聚集。當(dāng)應(yīng)用PPARα及PPARγ拮抗劑（GW6471，GW9662，終濃度均為10μmol/L）預(yù)孵育全血樣本時，結(jié)果顯示，雖然辛伐他汀具有PPARα及PPARγ雙重激活作用，但是只有PPARγ拮抗劑(GW9662)可以逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用，拮抗PPARα雖有逆轉(zhuǎn)趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)意義。通過采用共聚焦顯微鏡觀察血小板粘附功能，也得到類似的結(jié)論，證實辛伐他汀可以通過PPARs激

5、活，發(fā)揮抑制血小板粘附的作用，并且，PPARγ活化在其中起主要作用。
　　進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀體外孵育可呈劑量相關(guān)性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板CD62p表達(dá)升高（10μmol/L辛伐他汀組49.9％±4.21，30μmol/L辛伐他汀組26.8％±2.89 v.s.陽性對照組74.6％±4.25，P＜0.05），以及血小板PAC-1表達(dá)升高（10μmol/L辛伐他汀組55.6％±6.01，30μmol/L辛伐他汀組35.3％±4.

6、85 v.s.陽性對照組85.2％±4.16，P＜0.05）。當(dāng)聯(lián)合PPARs拮抗劑孵育，PPARγ拮抗劑(GW9662)可顯著逆轉(zhuǎn)不同濃度辛伐他汀對血小板CD62p表達(dá)的抑制作用（10μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組62.3％±3.41 v.s.10μmol/L辛伐他汀組49.9％±4.21 P＜0.05，30μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組37.8％±2.59 v.s.30μmol/L辛伐他汀組26.8％±2.89，P＜

7、0.05），及對血小板PAC-1表達(dá)的抑制作用（10μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組74.5％±5.68 v.s.10μmol/L辛伐他汀組55.6％±6.01 P＜0.05，30μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組47.9％±3.85 v.s.30μmol/L辛伐他汀組35.3％±4.85，P＜0.05），而PPARα拮抗劑(GW6471)未觀察到明顯的逆轉(zhuǎn)作用。
　　類似的結(jié)果也反映在血小板胞漿鈣離子濃度變化上，我們的

8、研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀體外孵育可呈劑量相關(guān)性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板胞漿[Ca2+]i升高（3μmol/L辛伐他汀組981±35.62 nmol/L，30μmol/L辛伐他汀組654±43.54 nmol/L，50μmol/L辛伐他汀組392±30.55 nmol/L v.s.陽性對照組1287±50.1 nmol/L，P＜0.05)。同時，當(dāng)聯(lián)合PPARs拮抗劑孵育，結(jié)果顯示，PPARγ拮抗劑(GW9662)可顯著逆轉(zhuǎn)不同濃度辛伐他汀對血小板

9、胞漿[Ca2+]i升高的抑制作用（3μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組1159±38.62 nmol/L v.s.3μmol/L辛伐他汀組981±35.62 nmol/L P＜0.05，30μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組989±37.55 nmol/L v.s.30μmol/L辛伐他汀組654±43.54 nmol/L P＜0.05，50μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組555±37.2 nmol/L v.s.50μmo

10、l/L辛伐他汀組392±30.55 nmol/L，P＜0.05），而PPARα拮抗劑(GW6471)未觀察到明顯的逆轉(zhuǎn)作用。
　　通過對血小板cAMP水平及VASP-Ser157磷酸化的研究也證實，不同濃度辛伐他汀體外孵育可顯著增加血小板cAMP水平（3μmol/L辛伐他汀組9.5±0.36 pmol/mL，30μmol/L辛伐他汀組22.4±0.72 pmol/mL，50μmol/L辛伐他汀組30.5±0.64 pmol/mL

11、v.s.陽性對照組5.2±0.58pmol/mL，P＜0.05）。而血小板胞漿cAMP是抑制血小板活化的重要因素。同時，血小板cAMP升高可引起VASP Ser157磷酸化，而辛伐他汀體外孵育可呈劑量依賴性促進(jìn)VASP Ser157磷酸化，這與其升高血小板cAMP水平作用一致。當(dāng)聯(lián)合PPARs拮抗劑孵育，結(jié)果顯示，PPARγ拮抗劑(GW9662)可顯著逆轉(zhuǎn)不同濃度辛伐他汀對血小板cAMP的升高作用（3μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662

12、組7.1±0.54 pmol/mL v.s.3μmol/L辛伐他汀組9.5±0.36 pmol/mL P＜0.05，30μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組15.4±0.68 pmol/mL v.s.30μmol/L辛伐他汀組22.4±0.72 pmol/mLP＜0.05，50μmol/L辛伐他汀聯(lián)合GW9662組21.5±0.71 pmol/mL v.s.50μmol/L辛伐他汀組30.5±0.64 pmol/mL，P＜0.05），

13、而PPARα拮抗劑(GW6471)未觀察到明顯的逆轉(zhuǎn)作用。與之一致的，當(dāng)聯(lián)合GW9662拮抗共同孵育，結(jié)果表面，拮抗PPARγ活性，可逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對血小板VASP Ser157磷酸化的抑制作用。
　　通過對相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀體外孵育可呈劑量依賴性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板胞漿Akt磷酸化，而后者可進(jìn)一步調(diào)控血小板聚集、分泌等多種反應(yīng)。當(dāng)聯(lián)合PPARγ拮抗劑GW9662與辛伐他汀共同孵育，可顯著逆轉(zhuǎn)后者對膠原誘導(dǎo)的血小板

14、Akt磷酸化的抑制作用。此外絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號傳導(dǎo)通路在血小板活化中具有重要作用，血小板cAMP水平變化及Akt磷酸化與MAPKs信號傳導(dǎo)通路（ERK1/2，p38 MAPK，JNK）活化密切相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可呈劑量依賴性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板p38 MAPK及ERK1/2磷酸化，而對JNK磷酸化無明顯影響。聯(lián)合PPARγ拮抗劑(GW966

15、2)與辛伐他汀共同孵育，可逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對膠原誘導(dǎo)的血小板p38 MAPK及ERK1/2磷酸化的抑制作用。
　　更進(jìn)一步的，通過免疫共沉淀的方法證明，辛伐他汀可呈劑量依賴性的增加膠原誘導(dǎo)的血小板胞漿PPARγ與p38 MAPK及ERK1/2的結(jié)合，結(jié)果表明，辛伐他汀可通過PPARγ與MAPKs(p38 MAPK，ERK1/2)信號通路產(chǎn)生直接相互作用，并可通過此種作用影響MAPK通路(p38MAPK及ERK1/2)磷酸化。
　

16、　結(jié)論:
　　1.辛伐他汀具有PPARα及PPARγ雙重激活作用，并可呈時間及劑量依賴性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集和粘附，PPARγ活化在其中發(fā)揮重要作用。
　　2.辛伐他汀主要通過PPARγ活化抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化標(biāo)志物P-選擇素及PAC-1表達(dá)，并抑制血小板胞漿[Ca2+]i濃度升高，同時可通過PPARγ活化促進(jìn)血小板cAMP水平及VASP Ser157磷酸化。
　　3.辛伐他汀可通過PPARγ活化抑制膠原誘導(dǎo)的