薤白皂苷抑制ADP誘導(dǎo)大鼠血小板活化及聚集的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、【目的】
　　1.設(shè)立冠心病患者組并以健康志愿者為對(duì)照，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離和鑒定相關(guān)差異蛋白，初步闡明差異蛋白在冠心病中的作用。
　　2.分別測(cè)定不同劑量薤白皂苷化合物對(duì)ADP誘導(dǎo)活化的大鼠血小板膜糖蛋白CD62P表達(dá)率及血小板聚集率的影響，探討薤白皂苷化合物對(duì)血小板活化和聚集過程的影響。
　　3.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出最優(yōu)劑量薤白皂苷化合物作用下的大鼠血小板差異蛋白，探究差異蛋白在血小板活化及聚集中的作用。

2、r>　　【研究方法】
　　1.為探討冠心病患者血小板蛋白質(zhì)組學(xué)改變，本研究納入冠心病患者組以及健康志愿者人組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，靜脈抽取10ml空腹全血，采用差速離心的方法制備血小板，將血小板溶于Lysis buffer中，并通過丙酮沉淀的方法提取蛋白，用基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectro

3、metry，MALDI-TOF-TOF）進(jìn)行鑒定，并查詢差異蛋白作用。分析其對(duì)冠心病發(fā)展的影響。
　　2.為了驗(yàn)證薤白皂苷作用后血小板活化功能的改變，研究選擇雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。用生理鹽水（2mL/d）、阿司匹林（30mg/kg/d）、不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷化合物灌胃大鼠7天后，制備大鼠血小板懸液，加入終濃度20μM ADP激活10min。檢測(cè)大鼠血小板膜糖蛋白CD62P表達(dá)

4、率，探討不同劑量薤白皂苷化合物作用血小板后的活化功能改變。
　　3.為了驗(yàn)證薤白皂苷作用后血小板聚集功能的改變，研究選擇雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。用生理鹽水（2mL/d）、阿司匹林（30mg/kg/d）、不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷化合物灌胃大鼠7天后，制備大鼠血小板懸液，加入終濃度20μM ADP激活10min。檢測(cè)大鼠血小板聚集率，探討不同劑量薤白皂苷化合物作用血小板后的聚集功能改變

5、。
　　4.為了鑒定最優(yōu)劑量薤白皂苷化合物作用下的大鼠血小板差異蛋白，探討薤白皂苷對(duì)ADP誘導(dǎo)大鼠血小板的蛋白質(zhì)組影響。研究選擇雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)處理組：2mL/d生理鹽水對(duì)照組、最優(yōu)劑量薤白皂苷組（經(jīng)檢測(cè)為抑制血小板活化和聚集的最優(yōu)劑量）。用上述劑量灌胃大鼠7天后制備血小板懸液，加入終濃度20uM ADP激活10min。提取血小板蛋白質(zhì)采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離及鑒定，并探究差異蛋白在血小板活化和聚集環(huán)節(jié)所起作用。

6、
　　【結(jié)果】
　　1.通過雙向電泳分別獲得2張冠心病患者凝膠和健康志愿者凝膠，分析出17個(gè)差異蛋白。質(zhì)譜鑒定并搜索數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)，與健康志愿組相比，冠心病組有7個(gè)蛋白表達(dá)出現(xiàn)差異：Plastin-2、Coronin-1A、Clusterin、Annexin A1、Chloride intracellular channel protein1、Peroxiredoxin-6、Peroxiredoxin-2。
　　2.流式

7、細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷均能一定程度上降低CD62P表達(dá)率，且呈一定的濃度依賴性，且薤白高劑量組抑制作用最為顯著。
　　3.血小板聚集率結(jié)果顯示，不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷與對(duì)照組相比，均能一定程度上抑制血小板的聚合作用，且亦呈一定的濃度依賴性。根據(jù)血小板抑制率公式計(jì)算阿司匹林組、薤白低劑量組、薤白中劑量

8、組、薤白高劑量組對(duì)ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制率依次為19.08％、14.46%、22.06%、33.85%。薤白高劑量組作用更為突出。
　　4.薤白皂苷高劑量處理組和對(duì)照組血小板總蛋白分別獲得3張凝膠圖譜，質(zhì)譜并搜索數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，薤白高劑量處理組有7個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)改變：Calreticulin、Actin、LIM and SH3 domain protein1、RCG55135、Protein phosphata

9、se1、Suppressor of IKBKE1、Ribulose-5-phosphate-3-epimerase。
　　【結(jié)論】
　　1.血小板蛋白質(zhì)Plastin-2、Peroxiredoxin-2、Peroxiredoxin-6、Annexin A1、Chloride intracellular channel protein1、Clusterin、Coronin-1A是冠心病患者與健康人差異表達(dá)蛋白。
　　2.