血小板促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡和難以治療的主要原因。血小板可以增加腫瘤細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移器官的植入和生長(zhǎng)，而抗血小板藥物可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，但血小板促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制還不完全明了。因此，研究血小板促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制對(duì)腫瘤的治療具有重要的意義。
　　 目的：研究血小板在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用，分析血小板促進(jìn)腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制。
　　 方法

2、：采用人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞系(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)和五種易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞系（結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、骨肉瘤細(xì)胞系HOS和MG-63）作為研究的細(xì)胞模型。五種腫瘤細(xì)胞系分別經(jīng)缺氧24小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)培養(yǎng)活化后，與熒光染料BCECF標(biāo)記的血小板共孵育，通過(guò)連續(xù)光譜熒光儀檢測(cè)血小板與五種腫瘤細(xì)胞的粘附，并分別給予抗血小板粘附分子的抗

3、體以分析血小板不同粘附分子在介導(dǎo)血小板與腫瘤細(xì)胞粘附中的作用。LSEC經(jīng)缺氧24小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)培養(yǎng)活化后，與熒光染料BCECF標(biāo)記的血小板共孵育，通過(guò)連續(xù)光譜熒光儀檢測(cè)血小板與LSEC的粘附，并給予抗血小板及內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的抗體以分析不同粘附分子在介導(dǎo)血小板與LSEC粘附中的作用。比較存在或缺乏血小板的情況下，腫瘤細(xì)胞在LSEC的粘附，并通過(guò)不同抗粘附分子的抗體阻斷作用以分析血小板促進(jìn)腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的分子機(jī)制。通過(guò)染料轉(zhuǎn)移、流

4、式細(xì)胞術(shù)和免疫電子顯微鏡檢測(cè)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞粘附后的細(xì)胞融合。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡和膠體金免疫電子顯微鏡技術(shù)確定血小板促進(jìn)腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的直接證據(jù)。為進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們從BALB/c裸鼠尾靜脈分別注射腫瘤細(xì)胞或粘附有血小板的腫瘤細(xì)胞，兩周后摘取動(dòng)物肺組織比較腫瘤細(xì)胞在肺的轉(zhuǎn)移灶，并通過(guò)病理切片檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況。另外，我們將腫瘤細(xì)胞單獨(dú)或與血小板共同分別接種到BALB/c裸鼠皮下，兩周后觀察腫瘤細(xì)胞的成瘤情況和腫

5、瘤大小，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色比較兩組腫瘤組織中的微血管密度。
　　 結(jié)果：血小板與缺氧．復(fù)氧后的五種腫瘤細(xì)胞的粘附明顯增加，與對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞相比存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同的腫瘤細(xì)胞與血小板的粘附可以分別被不同的抗血小板粘附分子的抗體阻斷，其中血小板與A549和HCT116兩種腫瘤細(xì)胞的粘附被抗gpⅠb、gpⅡb和gpⅢa的抗體阻斷，血小板與MG63細(xì)胞的粘附被抗gpⅡb和CD36的抗體阻斷，血小板與MDA-MB-231細(xì)胞的粘

6、附被抗gpⅠb、gpⅡb、gpⅢa和CD31的抗體阻斷，血小板與HOS細(xì)胞的粘附被抗gpⅠb和gpⅡb抗體阻斷。血小板與缺氧一復(fù)氧后的LSEC粘附也明顯升高，與對(duì)照組LSEC相比也存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且可以被抗粘附分子gpⅠb、gpⅡb、gpⅢa、P-selectin和CD31的抗體阻斷。在存在血小板的情況下，腫瘤細(xì)胞與LSEC的粘附明顯增加，并且腫瘤細(xì)胞的粘附數(shù)量與加入的血小板的數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，不同抗血小板粘附分子的抗體可以選擇

7、性地阻斷血小板介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞-LSEC粘附。染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血小板與LSEC粘附后，血小板中的熒光染料可以轉(zhuǎn)移到粘附的LSEC中；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，血小板與LSEC粘附后，血小板表面的特有粘附分子gpⅡb轉(zhuǎn)移到LSEC細(xì)胞表面；透射電子顯微鏡證實(shí)，血小板與缺氧-復(fù)氧的LSEC粘附并且部分胞膜發(fā)生融合。激光共聚焦顯微鏡觀察到，腫瘤細(xì)胞粘附到有血小板粘附的LSEC表面。采用膠體金免疫電子顯微鏡技術(shù)，清楚地證明血小板位于腫瘤細(xì)胞和LSEC

8、之間介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與LSEC的粘附。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，與血小板粘附的腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射后，其肺表面腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量明顯高于無(wú)血小板的對(duì)照組，兩組間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；并且肺組織中腫瘤細(xì)胞克隆數(shù)也明顯多于對(duì)照組。裸鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞2周后，與血小板混合的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，腫瘤體積明顯大于無(wú)血小板的對(duì)照組。組織學(xué)檢查顯示，混合血小板的腫瘤組織中微血管密度顯著高于無(wú)血小板的對(duì)照組。
　　 結(jié)論：血小板表面存在與血管內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)