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文檔簡介
1、目的:建立檢測苯并[a]芘(BaP)染毒大鼠血液和組織中BaP代謝產物3-羥基苯并[a]芘(3-OHBaP)、(+)-anti-7,8-二氫二羥基-9,10-環(huán)氧苯并[a]芘(BPDE)-DNA加合物的高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC/FD)。同時研究3-OHBaP在大鼠血液和心、脾、肺、腎、胃、腸、腦、肌肉中的時間-劑量-效應關系,(+)-anti-BPDE-DNA加合物在大鼠血液和肺、腎、腦中的時間-劑量-效應關系,探討二者血液濃
2、度與各組織濃度的相關性,討論以血液3-OHBaP和(+)-anti-BPDE-DNA加合物作為BaP暴露標志物的可行性。
方法:取純度為96%的BaP溶于玉米油中,分別配制成濃度為高(10mg/mL)、中(5mg/mL)、低(0.5mg/mL)劑量的灌胃液待用。雄性SD大鼠224只,體重180-220g,實驗前禁食12h,自由飲水。所有大鼠隨機分成4組,每組56只,每只大鼠灌胃2mL,建立高劑量組(100mg/kg)、中劑
3、量組(50mg/kg)、低劑量組(5mg/kg)和空白對照組(0mg/kg)。于灌胃后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h各時間點取8只大鼠斷頭處死。立即取血,收集到預先加入抗凝劑的EP管中,輕輕與抗凝劑混勻。血樣分為2個部分,一部分離心取血漿,另一部分留取全血,用以提取全血DNA。同時迅速取出大鼠的心、脾、肺、腎、胃、腸、腦、肌肉等組織置于生理鹽水中,洗凈,濾紙吸干組織表面水份,將各臟器平均分成2份,一份稱取臟器濕重,加4
4、倍生理鹽水勻漿,制成組織勻漿液,另一份裝密封袋。所有血液及組織樣本于-20℃保存,待測。取樣本1mL血漿,加入2mL丙酮,渦旋5min,離心10min,取上層有機相,蒸干。而后加入150μL丙酮,50μL熒光衍生劑碘乙烷和0.1g無水硫酸鈉,90℃水浴10min;取上述大鼠組織勻漿液樣品100μL于離心管中,加入200μL乙腈,渦旋混合1min,離心10min(10000r/min),取上清液20μL進樣;取上述200μL全血、50mg
5、組織樣品,分別用試劑盒處理提取DNA,提取后的DNA在0.1mol/LHC1、90℃恒溫水浴酸解4h,乙酸乙酯提取(+)-anti-BPDE-DNA加合物水解產物I-1型苯并芘-四醇(BaP-tetrolI-1),蒸干乙酸乙酯后,200μLDMSO復溶,取20μL進樣。利用HPLC/FD法在甲醇/水(97/3,pH4.5),流速0.5mL/min,激發(fā)波長365nm,檢測波長450nm的色譜條件下外標法檢測3-OHBaP;在甲醇/水(5
6、5/45,pH7.0),流速1mL/min,激發(fā)波長245nm,檢測波長395nm的色譜條件下外標法檢測BaP-tetrolI-1。SPSS統(tǒng)計學軟件分析實驗結果。探討大鼠血液及組織3-OHBaP及(+)-anti-BPDE-DNA加合物濃度時間-劑量-效應關系、血液濃度與組織濃度的相關性。
結果:HPLC/FD法能準確、簡便地檢測3-OHBaP及(+)-anti-BPDE-DNA加合物,樣品提取回收率良好,穩(wěn)定性良好;大
7、鼠血液、心、脾、肺、腎、腦、肌肉中3-OHBaP劑量-效應關系良好,血液、肺、腦中(+)-anti-BPDE-DNA加合物劑量-效應關系良好;血液中3-OHBaP濃度與心、脾、肺、腎、腦、肌肉濃度相關性良好,血液中(+)-anti-BPDE-DNA加合物濃度與肺、腦濃度相關性良好。
結論:本文建立了高效、穩(wěn)定的HPLC/FD檢測法,用于染毒大鼠血液及組織中3-OHBaP及(+)-anti-BPDE-DNA加合物的檢測。血液
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