矽塵暴露人群血清生物標(biāo)志物的篩選及其相關(guān)功能的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、矽肺(silicosis)是由于長期吸入大量游離二氧化硅(siO2)粉塵引起的以肺間質(zhì)纖維化為主的全身性疾病,在我國是危害最嚴(yán)重的職業(yè)病之一。在我國平均每例塵肺病人每年經(jīng)濟(jì)損失約為3.41萬元,每年僅因塵肺病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)140多億元,每年新增塵肺病例造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)6億元。近年來矽肺病的流行呈現(xiàn)出群發(fā)性、低齡化以及致殘率高的新特點,這給矽肺的防治工作帶來了新的挑戰(zhàn)。目前已發(fā)現(xiàn)許多對矽肺的診斷有價值的血清生物標(biāo)志物,如肺特異性的克

2、拉拉細(xì)胞蛋白(cc16)、肺表面活性物質(zhì)D(SP-D)作為診斷指標(biāo)仍存在敏感性、特異性不足的缺點,不同類型的肺間質(zhì)病之間這些指標(biāo)重疊較大;而支氣管肺泡灌洗液的化學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢查僅能作為影像學(xué)診斷的補(bǔ)充。運用新技術(shù)手段篩選高特異性、敏感性的標(biāo)志物將對矽肺的早期防治起到重要的推動。液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是一種基于磁珠分選與基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)聯(lián)合應(yīng)用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),可直接檢測臨床未經(jīng)特殊處理的血清

3、、尿液、腦脊液或漿膜腔積液等標(biāo)本,對疾病(特別是腫瘤)的診斷有較高的敏感性和特異性。本研究采用液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測矽塵暴露人群血清蛋白的表達(dá),篩選出矽肺發(fā)病早期的生物標(biāo)志物建立矽肺早期診斷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型并對鑒定出的標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)功能的初步研究。
   研究目的:
   應(yīng)用液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)篩選矽塵暴露人群早期診斷血清生物標(biāo)志物,并對鑒定出的生物標(biāo)志物進(jìn)行初步功能研究。
   研究方法:

4、r>   矽塵暴露人群85例為山西省陽泉市某耐火材料廠接觸游離二氧化硅粉塵的工人,統(tǒng)一攝高千伏X射線后前位胸片(120-150KV、100mA、0.03-0.05s),由具有診斷資格的診斷專家組按照《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)GBZ70-2002》進(jìn)行診斷,分為矽塵暴露組(無塵肺0期)、可疑矽肺組(無塵肺0+期)和Ⅰ期矽肺組;30例非暴露正常對照組為某單位年度體檢人員,均無矽塵暴露史。
   本研究首先應(yīng)用invitrogen公司生產(chǎn)的D

5、ynabeads RPC18磁珠,對矽塵暴露人群和非暴露正常對照組的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)(多肽)的分選,然后對分選后的蛋白(多肽)采用MALDI-TOF-MS的一級質(zhì)譜技術(shù)和ClinProTools分析軟件進(jìn)行差異蛋白峰的篩選,同時應(yīng)用Matlab分析軟件建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型,最后對篩選出的差異蛋白質(zhì)峰采用MALDI-TOF-MS二級質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行氨基酸序列鑒定。
   按照二級質(zhì)譜鑒定出來的氨基酸序列人工合成差異蛋白,并用不同濃度

6、的蛋白溶液作為刺激物,觀察其對矽肺形成過程中的靶細(xì)胞人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)的影響。
   研究結(jié)果:
   1.一級質(zhì)譜尋找差異顯著峰結(jié)果:利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法(SNN)建立模型進(jìn)行各組間兩兩比較,發(fā)現(xiàn)0期與0+期、0期與Ⅰ期、0+期與Ⅰ期比較,其識別率分別為64.35%、84.38%和73.49%,其交叉驗證能力分別為63.14%、52.82%和69.07%;而正常對照組(control)與0期、正常對照組與0+期

7、、正常對照組與Ⅰ期比較,其識別率分別為89.23%、98.52%和98.96%交叉驗證能力分別為87.66%、94.20%和85.53%。
   由上可知,0期與0+期、0期與Ⅰ期、0+期與Ⅰ期比較,其識別率和交叉驗證能力都較差;而正常對照組(control)與0期、正常對照組與0+期、正常對照組與Ⅰ期比較,其識別率和交叉驗證能力都較好。因此,僅對0期、0+期、Ⅰ期與正常對照組的差異顯著峰進(jìn)行提取,共得到5個差異峰(P<0.01

8、),其中5081Da和5066Da為表達(dá)上調(diào)的蛋白峰,2021da、3954da和1777da為表達(dá)下調(diào)的蛋白峰。
   2.二級質(zhì)譜鑒定差異顯著峰氨基酸序列結(jié)果:根據(jù)二級質(zhì)譜儀器要求,選擇分子量<3KDa的峰2021Da和1777Da進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列結(jié)果兩蛋白質(zhì)峰同為補(bǔ)體C3的一個片段C3f。
   3.矽塵暴露人群接塵量與差異峰強(qiáng)度相關(guān)性分析:接塵量與5081Da、5066Da、3954Da、2021Da

9、和1777Da5個差異顯著峰的峰強(qiáng)的相關(guān)系數(shù)依次為r5081=0.039(P=0.614)、r5066=0.104(P=0.180)、r3954=-0.047(P=0.543)、r2021=-0.028(P=-0.714)、r1777=-0.016(P=0.853),5個差異蛋白峰強(qiáng)度與接塵量均不存在相關(guān)性。
   4.矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的建立:篩選出峰效果較好的2021Da、2554Da.、5066Da、8600

10、Da.4個P(0.001的共同差異蛋白質(zhì)峰建立矽塵暴露人群診斷模型,其區(qū)分矽塵暴露人群與正常對照組的特異性為100%,敏感性為90%,準(zhǔn)確率為92.3%;該模型診斷O期、0+期和Ⅰ期的識別率分別為100%、93%和96%。
   5.不同濃度C3f刺激對MRC-5細(xì)胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1表達(dá)量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1的表達(dá)量均呈進(jìn)行性降低。與對照組相比,各濃度點均有顯著差異(P<

11、0.05)。
   6.不同濃度C3f刺激對MRO-5胞質(zhì)中TGF-β1表達(dá)量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,MRC-5胞質(zhì)中TGF-β1的積分光密度值呈進(jìn)行性降低,各濃度點均有顯著差異(P<0.05)
   研究結(jié)論:
   1.運用液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的一級質(zhì)譜尋找矽塵暴露人群差異蛋白,并成功建立了矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型。
   2.運用液體飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的二級質(zhì)譜技術(shù)鑒定出1777

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