異種克隆牦牛，羚牛及相關(guān)機(jī)理的研究.pdf

1、在保護(hù)瀕危動(dòng)物和進(jìn)行核質(zhì)互作分析方面,異種克隆技術(shù)是非常有效的方法.該研究利用牛卵母細(xì)胞作為受體,通過顯微操作與牦牛或羚牛體細(xì)胞構(gòu)建異種重構(gòu)胚,將牦牛的異種重構(gòu)胚移植到代孕牛中,獲得了妊娠,并有望于2004年6-7月間出生.此外該研究還對異種克隆技術(shù)和異種體細(xì)胞核重編程進(jìn)行了初步探討.1 供體細(xì)胞的培養(yǎng):該實(shí)驗(yàn)從北京動(dòng)物園、青?；ブh、秦皇島野生動(dòng)物園分別采集了羚牛和牦牛組織樣,建立了21個(gè)細(xì)胞系.2 體細(xì)胞克隆技術(shù)基礎(chǔ)平臺(tái)的建立:首先

2、,在去核方法上,該實(shí)驗(yàn)比較了H33342染色法,盲吸法和高滲法并結(jié)合這三種方法作了優(yōu)化,形成該實(shí)驗(yàn)的去核方法;其次,該實(shí)驗(yàn)利用牛卵母細(xì)胞孤雌激活的方法,比較了四種激活方法,發(fā)現(xiàn)利用復(fù)合激活方法比單個(gè)化學(xué)試劑激活效率高(83.6、68.7:45、62.5),而在復(fù)合激活的方法中以A23187+6-DMAP激活效率較高(分裂率,83.6);最后,通過比較M199培養(yǎng)液和CRlaa培養(yǎng)液對孤雌激活胚胎的培養(yǎng)效率,發(fā)現(xiàn)CRlaa培養(yǎng)液較適合牛胚

3、胎的培養(yǎng).3 異種克隆牦牛囊胚研究:該實(shí)驗(yàn)利用不同個(gè)體的牦牛耳成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞,分別作為供核細(xì)胞移入去核牛卵母細(xì)胞中,均可完成體外牦牛的早期囊胚發(fā)育(囊胚率高達(dá)35﹪).4 通過將羚牛和牦牛的異種克隆發(fā)育情況、囊胚總細(xì)胞數(shù)和克隆牛進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):(1)異種克隆羚牛胚胎在體外可以發(fā)育到囊胚階段,囊胚率為5﹪左右;(2)利用相同的克隆技術(shù),同種克隆牛、異種克隆牦牛、異種克隆羚牛之間克隆效率差異顯著(48﹪;28﹪;5﹪,P<0

4、.01)(3)三種克隆囊胚的細(xì)胞數(shù)無差異.5 由于異種克隆所用的卵母細(xì)胞不是同一物種,有必要對克隆后囊胚的核,線粒體遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定.該實(shí)驗(yàn)對異種克隆牦牛和羚牛囊胚鑒定結(jié)果表明:囊胚核基因組來自牦牛和羚牛供核細(xì)胞,說明該實(shí)驗(yàn)獲得的囊胚是真正異種體細(xì)胞克隆的結(jié)果;囊胚線粒體以午卵母細(xì)胞線粒體為主,牦牛或羚牛供體細(xì)胞線粒體含量甚微.6異種克隆牦牛胚胎進(jìn)行移植:共移植牦牛胚胎185枚,用受體牛60頭,其中有近33頭的受體牛返情期延長,移植后第

5、60天直腸檢查確認(rèn)有3頭懷孕.7個(gè)月后,1頭牛妊娠仍然正常,為通過異種克隆的方法保護(hù)珍稀動(dòng)物提供了依據(jù).7目前在較近的物種之間進(jìn)行異種體細(xì)胞克隆雖然已有成功的報(bào)道,但是多數(shù)報(bào)道的異種體細(xì)胞克隆都發(fā)育到囊胚階段,最多妊娠幾個(gè)月.該實(shí)驗(yàn)在異種克隆牦牛實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這一問題.為了較全面的探索其基因方面的原因,則需要對大量的候選基因進(jìn)行分析.而利用傳統(tǒng)的RT-PCR方法從單個(gè)卵母細(xì)胞或胚胎中獲得的RNA量不足以分析大量的基因.該研究利用并優(yōu)化了

6、一套全新的擴(kuò)增細(xì)胞中整體cDNA的方法,使微量材料進(jìn)行大量的基因表達(dá)分析成為現(xiàn)實(shí).通過該方法,該實(shí)驗(yàn)檢測了6個(gè)重要基因在牦牛體細(xì)胞和牛卵母細(xì)胞和牦牛異種體細(xì)胞克隆胚胎的表達(dá)情況;同時(shí)對牦牛異種體細(xì)胞克隆囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)/總細(xì)胞的比例進(jìn)行了檢測.8 在此次研究中發(fā)現(xiàn),作為干細(xì)胞標(biāo)志的Oct4基因在牛和牦牛體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中也有大量表達(dá).利用原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Oct4在牛卵母細(xì)胞、?？寺『虸VF胚胎、異種克隆牦牛胚胎、牛體外培養(yǎng)的細(xì)胞系和牦