異種克隆牦牛，羚牛及相關(guān)機理的研究.pdf

1、在保護瀕危動物和進行核質(zhì)互作分析方面,異種克隆技術(shù)是非常有效的方法.該研究利用牛卵母細胞作為受體,通過顯微操作與牦?；蛄缗ｓw細胞構(gòu)建異種重構(gòu)胚,將牦牛的異種重構(gòu)胚移植到代孕牛中,獲得了妊娠,并有望于2004年6-7月間出生.此外該研究還對異種克隆技術(shù)和異種體細胞核重編程進行了初步探討.1 供體細胞的培養(yǎng):該實驗從北京動物園、青海互助縣、秦皇島野生動物園分別采集了羚牛和牦牛組織樣,建立了21個細胞系.2 體細胞克隆技術(shù)基礎(chǔ)平臺的建立:首先

2、,在去核方法上,該實驗比較了H33342染色法,盲吸法和高滲法并結(jié)合這三種方法作了優(yōu)化,形成該實驗的去核方法;其次,該實驗利用牛卵母細胞孤雌激活的方法,比較了四種激活方法,發(fā)現(xiàn)利用復(fù)合激活方法比單個化學(xué)試劑激活效率高(83.6、68.7:45、62.5),而在復(fù)合激活的方法中以A23187+6-DMAP激活效率較高(分裂率,83.6);最后,通過比較M199培養(yǎng)液和CRlaa培養(yǎng)液對孤雌激活胚胎的培養(yǎng)效率,發(fā)現(xiàn)CRlaa培養(yǎng)液較適合牛胚

3、胎的培養(yǎng).3 異種克隆牦牛囊胚研究:該實驗利用不同個體的牦牛耳成纖維細胞、顆粒細胞和輸卵管細胞,分別作為供核細胞移入去核牛卵母細胞中,均可完成體外牦牛的早期囊胚發(fā)育(囊胚率高達35﹪).4 通過將羚牛和牦牛的異種克隆發(fā)育情況、囊胚總細胞數(shù)和克隆牛進行比較發(fā)現(xiàn):(1)異種克隆羚牛胚胎在體外可以發(fā)育到囊胚階段,囊胚率為5﹪左右;(2)利用相同的克隆技術(shù),同種克隆牛、異種克隆牦牛、異種克隆羚牛之間克隆效率差異顯著(48﹪;28﹪;5﹪,P<0

4、.01)(3)三種克隆囊胚的細胞數(shù)無差異.5 由于異種克隆所用的卵母細胞不是同一物種,有必要對克隆后囊胚的核,線粒體遺傳物質(zhì)進行鑒定.該實驗對異種克隆牦牛和羚牛囊胚鑒定結(jié)果表明:囊胚核基因組來自牦牛和羚牛供核細胞,說明該實驗獲得的囊胚是真正異種體細胞克隆的結(jié)果;囊胚線粒體以午卵母細胞線粒體為主,牦牛或羚牛供體細胞線粒體含量甚微.6異種克隆牦牛胚胎進行移植:共移植牦牛胚胎185枚,用受體牛60頭,其中有近33頭的受體牛返情期延長,移植后第

5、60天直腸檢查確認有3頭懷孕.7個月后,1頭牛妊娠仍然正常,為通過異種克隆的方法保護珍稀動物提供了依據(jù).7目前在較近的物種之間進行異種體細胞克隆雖然已有成功的報道,但是多數(shù)報道的異種體細胞克隆都發(fā)育到囊胚階段,最多妊娠幾個月.該實驗在異種克隆牦牛實驗中也發(fā)現(xiàn)了這一問題.為了較全面的探索其基因方面的原因,則需要對大量的候選基因進行分析.而利用傳統(tǒng)的RT-PCR方法從單個卵母細胞或胚胎中獲得的RNA量不足以分析大量的基因.該研究利用并優(yōu)化了

6、一套全新的擴增細胞中整體cDNA的方法,使微量材料進行大量的基因表達分析成為現(xiàn)實.通過該方法,該實驗檢測了6個重要基因在牦牛體細胞和牛卵母細胞和牦牛異種體細胞克隆胚胎的表達情況;同時對牦牛異種體細胞克隆囊胚的內(nèi)細胞團/總細胞的比例進行了檢測.8 在此次研究中發(fā)現(xiàn),作為干細胞標(biāo)志的Oct4基因在牛和牦牛體外培養(yǎng)的細胞系中也有大量表達.利用原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Oct4在牛卵母細胞、?？寺『虸VF胚胎、異種克隆牦牛胚胎、牛體外培養(yǎng)的細胞系和牦