普氏原羚——牛異種動(dòng)物克隆研究.pdf

1、普氏原羚(Procapra przewalskii)，亦稱(chēng)普氏小羚羊，是世界上最瀕危物種之一，為中國(guó)特有珍惜瀕危物種。屬偶蹄目、牛科、羚羊亞科、原羚屬動(dòng)物，歷史上曾分布于內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏和青海。它形態(tài)大小與藏原羚相似，曾被看作是藏原羚的一個(gè)亞種，實(shí)為獨(dú)立種。本研究以普氏原羚的成體細(xì)胞作為核供體，以牛的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)，進(jìn)行異種克隆操作，探討普氏原羚異種克隆的可行性。從青海野生動(dòng)物園的一只健康成年普氏原羚的耳源部采得約0.5cm2的

2、組織1塊，經(jīng)體外培養(yǎng)后，得到成纖維細(xì)胞。從細(xì)胞水平對(duì)普氏原羚體細(xì)胞培養(yǎng)、生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定、核型制備與分析、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化等方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。從屠宰場(chǎng)收集牛卵巢，采得卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，經(jīng)體外培養(yǎng)后，獲得成熟卵母細(xì)胞。使用去乙?；敢种苿┨幚懋惙N重構(gòu)胚，采用常規(guī)體細(xì)胞核移植技術(shù)和改進(jìn)后的反向核移植技術(shù)，觀察了普氏原羚異種克隆胚的發(fā)育情況。結(jié)果如下：
　　 1、普氏原羚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在38.5℃，CO2濃度為5.0％的

3、條件下，經(jīng)過(guò)0.5％血清饑餓處理2天，當(dāng)細(xì)胞的匯合度為50％-60％，70％-80％，95％-100％時(shí)，G0/G1期細(xì)胞的百分比分別為77.03％，77.51％和92.25％。長(zhǎng)滿(mǎn)后(接觸抑制使細(xì)胞大部分處于G0/G1期)的體細(xì)胞與血清饑餓處理的體細(xì)胞在進(jìn)行核移植時(shí)，效果是一致的。細(xì)胞成梭型長(zhǎng)條狀或不規(guī)則多角形、邊緣清晰。經(jīng)細(xì)胞冷凍、復(fù)蘇后，細(xì)胞活力無(wú)明顯改變。細(xì)胞的染色體數(shù)目為60條，但是隨著培養(yǎng)代次的增加，染色體的非整倍性會(huì)逐漸增

4、加，表明體外培養(yǎng)系統(tǒng)會(huì)對(duì)細(xì)胞染色體倍性產(chǎn)生一定影響。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的紅色熒光蛋白(pDS-Red2)和Oct-4-eGFP轉(zhuǎn)染普氏原羚成纖維細(xì)胞，最佳的轉(zhuǎn)染條件是15μl Lipfectamine LTX及4μg質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染體系。
　　 2、分別以不同濃度的去乙?；敢种苿￢alproi cacid(VPA)對(duì)普氏原羚-牛異種重構(gòu)胚處理不同時(shí)間，觀察克隆胚胎的發(fā)育。結(jié)果表明，0.5mM的VPA處理24h可以顯著提高克隆胚胎8-

5、16細(xì)胞的發(fā)育率(61.9％vs50.7％)。但是，與未處理的對(duì)照組相比，異種克隆胚胎的桑椹胚和囊胚發(fā)育都沒(méi)有顯著性差異(1.2％vs1.6％，P>0.05；0.8％vs1.6％，P>0.05)；用0.5mM的VPA處理轉(zhuǎn)基因細(xì)胞來(lái)源(Oct-4-eGFP)的異種重構(gòu)胚，觀察異種重構(gòu)胚的發(fā)育。結(jié)果表明，經(jīng)VPA處理24h后，試驗(yàn)組與對(duì)照組在卵裂率(78.4％vs71.4％)、8-16細(xì)胞發(fā)育率(62.1％vs58.5％)、桑椹胚發(fā)育率(

6、1.3％vs1.9％)和囊胚發(fā)育率(0.7％vs1.3％)等方面均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；用30nM的TrichostatinA(TSA)處理重構(gòu)胚24h，觀察異種重構(gòu)胚的發(fā)育情況。TSA處理組在各個(gè)時(shí)期顯著高于對(duì)照組，囊胚率也得到明顯提高(3.6％/3.0％vs0.8％/0.9％，P<0.05)，獲得3枚表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)Oct-4-eGFP的普氏原羚一牛的異種克隆囊胚；通過(guò)反向核移植法進(jìn)行異種核移植操作，觀察異種重構(gòu)胚的發(fā)育情況

7、。結(jié)果表明，在卵裂率(61.1％vs63.5％)和8-16細(xì)胞發(fā)育率(45.6％vs49.0％)上沒(méi)有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組得到1枚囊胚；為了探索普氏原羚-牛的異種克隆胚胎發(fā)育低的問(wèn)題，本研究還對(duì)異種重構(gòu)胚、受體卵母細(xì)胞、供體細(xì)胞、牛-牛同種克隆胚胎等進(jìn)行了芯片檢測(cè)。結(jié)果顯示，與供體細(xì)胞、卵母細(xì)胞相比，8-16細(xì)胞期異種重構(gòu)胚激活643個(gè)基因，而8-16細(xì)胞期?？寺∨咛ゼせ盍?527個(gè)基因。異種重構(gòu)胚只激活了部分與重編程相關(guān)的基因。與牛體細(xì)

8、胞相比，普氏原羚體細(xì)胞中有1010個(gè)基因沒(méi)有被有效沉默。提示異種來(lái)源的供體細(xì)胞在核重編程過(guò)程中進(jìn)行的不徹底。
　　 以上結(jié)果表明，雖然牛的卵母細(xì)胞質(zhì)可以支持普氏原羚體細(xì)胞發(fā)生重編程，異種重構(gòu)胚可以發(fā)育到囊胚，但是囊胚發(fā)育率均很低。利用VPA處理重構(gòu)胚未能提高囊胚發(fā)育率；而TSA處理重構(gòu)胚明顯提高了囊胚發(fā)育率；異種囊胚能夠表達(dá)重編程因子Oct-4。組學(xué)分析初步表明，異種重構(gòu)胚只能激活部分與重編程相關(guān)的胚胎發(fā)育基因，供體細(xì)胞的基因還