蘋果苦痘病相關(guān)機(jī)理及相關(guān)基因表達(dá)分析.pdf

1、苦痘病是常見(jiàn)的生理病害，影響蘋果的外觀和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究利用物理的辦法分離了蘋果果肉單細(xì)胞，并且用熒光染色劑（VBL）證明細(xì)胞的完整性，用熒光素雙醋酸酯探針（FDA）證明了細(xì)胞的活性。以紅富士蘋果為材料，對(duì)其進(jìn)行噴鈣處理和萘乙酸（NAA）、赤霉素（GA）處理，統(tǒng)計(jì)了各個(gè)處理的紅富士蘋果田間發(fā)病率以及在貯藏期間的發(fā)病率，測(cè)定了蘋果在貯藏期間的硬度、可溶性固形物、可滴定酸、維生素C含量、以及氧化酶活性等。利用高通量測(cè)序技術(shù)，探索了苦痘病相關(guān)

2、的基因，為研究其發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.蘋果果肉單細(xì)胞的分離提取以及活性驗(yàn)證
　　本實(shí)驗(yàn)采用物理的辦法，分離紅富士蘋果果肉的單細(xì)胞，利用 VBL與纖維素親和的特性，能確定細(xì)胞壁的完整性。并利用 FDA能夠使活性物質(zhì)產(chǎn)生綠色熒光的特性，確定細(xì)胞的活性。結(jié)果表明，終濃度0.1％的離析酶，以及0.5h的酶解時(shí)間可以獲得完整的果肉單細(xì)胞。
　　2.生長(zhǎng)期間鈣和激素處理對(duì)蘋果苦痘病發(fā)病率及貯藏品質(zhì)的影響

3、r>　　蘋果苦痘病主要發(fā)生在成熟期和貯藏期，本試驗(yàn)通過(guò)三種濃度（0.5%、1%和2%）的葡萄糖酸鈣處理，均能一定程度的降低蘋果貯藏期間苦痘病的發(fā)病率。在0-60 d整個(gè)貯藏期間，紅富士蘋果果實(shí)硬度下降，與對(duì)照相比，不同濃度的鈣處理都延緩蘋果貯藏期間果實(shí)硬度的下降，且2%葡萄糖酸鈣的處理效果最好，比如套袋蘋果的硬度由9.65kg·cm-2降到6.8kg·cm-2。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，所有處理的蘋果的可溶性固形物（TSS）含量都呈先升高后下降

4、的趨勢(shì)；可滴定酸(TA)和維生素C含量也都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在套袋蘋果與不套袋蘋果中，噴施不同濃度的葡萄糖酸鈣和激素能夠減緩TA含量的下降，這說(shuō)明葡萄糖酸鈣能一定程度的減慢果實(shí)的呼吸作用，NAA1ppm和GA20ppm也能減緩果實(shí)的呼吸作用；激素處理對(duì)減緩貯藏期間果實(shí)維生素C含量的下降有一定的作用。
　　3.生長(zhǎng)期間鈣和激素處理對(duì)果實(shí)氧化酶活性的影響
　　在整個(gè)貯藏期，蘋果果實(shí)的 SOD、CAT活性都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，

5、且果實(shí)的SOD和CAT酶的變化趨勢(shì)和出現(xiàn)高峰時(shí)間基本一致；而POD一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏期間，0.5%葡萄糖酸鈣、1%葡萄糖酸鈣、2%葡萄糖酸鈣處理果實(shí)的SOD活性都比對(duì)照果實(shí)高，而且2%葡萄糖酸鈣處理的果實(shí)的SOD活性在整個(gè)貯藏期間是最高的。NAA和GA處理的果實(shí)，在0-15d和45-60d這兩個(gè)階段，激素處理的果實(shí)的SOD酶活性高于對(duì)照，其他貯藏階段則低于對(duì)照。說(shuō)明噴鈣可以提高酶的活性；而激素處理對(duì)果實(shí)SOD酶活性的影響不大

6、。NAA和GA處理的果實(shí)的POD酶活，在0-15d這個(gè)階段激素處理的果實(shí)的POD酶活都高于對(duì)照CK，但是在30d之后，都低于對(duì)照CK。2%葡萄糖酸鈣處理能夠提高果實(shí)CAT酶的活性。NAA和GA處理的果實(shí)與對(duì)照CK并沒(méi)有明顯差異，都在45d的時(shí)候，達(dá)到最大值。
　　4.蘋果苦痘病相關(guān)基因的熒光定量表達(dá)分析
　　實(shí)驗(yàn)以青島萊西某果園的紅富士為材料，對(duì)其采后0 d、30 d的果實(shí)分別取樣，采樣設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)兩個(gè)蘋果，

7、采集后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用采用TIANGEN的RNAplant Plus試劑提取植物材料總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用Illumina HiseqTM2000高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)結(jié)果分析 RPKM值，初步獲得苦痘病相關(guān)基因集合?；谖墨I(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)前期研究，著重查找和分析與鈣離子運(yùn)轉(zhuǎn)、鈣結(jié)合蛋白、生長(zhǎng)素相關(guān)的基因。以Actin作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（96孔板）進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)

8、一步縮小備選基因集，發(fā)現(xiàn)具有價(jià)值的關(guān)鍵基因。這些基因在苦痘病發(fā)病果實(shí)與苦痘病未發(fā)病果實(shí)中的表達(dá)趨勢(shì)不同：與鈣相關(guān)的基因LOC103456257和LOC103410497在苦痘病未發(fā)病果實(shí)中的表達(dá)量低于發(fā)病果實(shí);與生長(zhǎng)素有關(guān)的基因LOC103434427在0 d、30 d、60 d的表達(dá)趨勢(shì)基本一致；與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因LOC103431247在苦痘病未發(fā)病的果實(shí)中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于苦痘病發(fā)病果實(shí)。
　　由以上結(jié)果可以得出，用物

9、理辦法能夠分離具有活性的蘋果單細(xì)胞；噴鈣處理會(huì)有效的提高果實(shí)在貯藏期間的品質(zhì)，會(huì)一定程度的降低苦痘病發(fā)病率；激素處理對(duì)苦痘病發(fā)病果實(shí)與未發(fā)病果實(shí)的影響差異不大；與鈣相關(guān)的基因LOC103456257和LOC103410497，與生長(zhǎng)素有關(guān)的基因LOC103434427，與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)的基因LOC103427254和LOC103431247，在苦痘病發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，但是這些基因具體如何調(diào)控苦痘病的發(fā)病機(jī)理，還有待進(jìn)一步研究。