微生物細胞非水相催化羰基化合物的不對稱還原.pdf

1、在許多領(lǐng)域中，尤其是在藥物工業(yè)領(lǐng)域，獲得單一對映體純的手性化合物是非常必要的。具有光學(xué)活性的鹵代β-羥基酯和1-苯乙醇衍生物是合成多種手性藥物和其他生物活性化合物的重要砌塊。結(jié)合非水相生物催化的優(yōu)勢利用微生物細胞催化不對稱還原羰基化合物可以有效地制備這些手性醇。 建立了用氣相色譜法測定手性醇對映體純度的方法。用β-環(huán)糊精(β-CD)手性固定相在氣相色譜上分離了乙?；?-氯-3-羥基丁酸乙酯，考察了色譜條件對分離的影響。然后拆分

2、了各種外消旋醇，測定并計算熱力學(xué)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，載氣流速、柱溫、程序升溫速率、起始溫度維持時間和進樣量對對映體在β-CD上的分離有明顯影響；芳基醇無需衍生化普遍能得到較好的分離，β-CD固定相對芳基醇的手性識別明顯要優(yōu)于直鏈羥基酸酯。通過熱力學(xué)數(shù)據(jù)的分析認為，色譜分離過程中存在焓-熵補償，這些化合物在β-CD固定相上的拆分機理是基本一致的。 考察了有機溶劑對微生物細胞的毒性。不同有機溶劑對出芽短梗霉GCMCC1244細胞的毒性各

3、異，毒性大小與疏水性參數(shù)logP存在相關(guān)性，logP從3到5是有機溶劑對出芽短梗霉細胞有毒到無毒的過渡區(qū)；海藻酸鈣細胞固定化可以減少有機溶劑對其的毒害作用；不同生長階段的微生物細胞對有機溶劑的毒性反應(yīng)不同，快速生長期(12h)的細胞較敏感。同一有機溶劑對枯草芽孢桿菌的毒性比出芽短梗霉和酵母要小，后兩種微生物的毒性反應(yīng)相近。 在水/有機溶劑兩相體系中用出芽短梗霉GCMCC1244細胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制備(S)-4

4、-氯-3-羥基丁酸乙酯(CHBE)。CHBE在水溶液中比較穩(wěn)定，而COBE容易被分解；兩者對微生物細胞都有毒害作用，其中COBE的毒性要大于CHBE；鄰苯二甲酸二丁酯是組成水/有機溶劑兩相體系的最適有機相，在兩相體系中可獲得較高的摩爾轉(zhuǎn)化率、光學(xué)純度和產(chǎn)物在有機相中的濃度。通過考察各種影響因素如相體積比、振搖速度、生物量/底物量比、溫度以及pH發(fā)現(xiàn)，這些因素對反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)初速度有明顯影響，但對產(chǎn)物的光學(xué)純度的影響很小。經(jīng)過條件

5、優(yōu)化后，有機相產(chǎn)物濃度可以達到58.2g/L，總摩爾轉(zhuǎn)化率可以達到93.2％，光學(xué)純度大于97％e.e.；固定化細胞反復(fù)利用不理想，COBE還原酶活力的損失并不是最主要的原因，而主要是因為固定化細胞經(jīng)過反應(yīng)后脫氫酶活力和還原酶的輔酶濃度大幅下降的緣故，影響了輔酶再生。 篩選得到一株能高立體選擇地催化還原TFAAE的菌株SaccharoinycesuvarumSW58，在水/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系中可以得到較好的結(jié)果，優(yōu)化條件下

6、，摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學(xué)純度分別可達85.1％和85.4％e.e.；添加合適的共底物、丙稀基溴處理細胞和用凍干細胞可以改善反應(yīng)的立體選擇性，細胞熱處理對反應(yīng)不利。 用4種微生物分別在水相體系和水/有機溶劑兩相體系催化還原了10種苯烷酮化合物。假絲酵母SW0401表現(xiàn)出很強的還原活力，10個底物被還原均有相應(yīng)的產(chǎn)物醇生成，但立體選擇性不高，釀酒酵母SW57對苯烷酮表現(xiàn)出普遍較高的立體選擇性，這兩種酵母催化苯乙酮還原反應(yīng)遵循了Pre

7、log規(guī)則。而在兩相體系中出芽短梗霉SW0202催化苯乙酮衍生物的不對稱還原反應(yīng)遵循反Prelog規(guī)則。朱紅密孔菌CGMCC1115的還原能力很低，僅能還原5種苯烷酮。苯烷酮苯環(huán)上取代基的電負性和結(jié)構(gòu)能影響還原反應(yīng)難易程度，取代基電負性強的容易被還原，取代基疏水性大不利于被還原；在水/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系中考察了釀酒酵母SW57催化還原2-氯苯乙酮，乙醇是較理想的輔助底物，其水相濃度以30g/L為宜。還原反應(yīng)的最適pH、溫度和機相初