鈣敏感受體在戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠模型心肌細(xì)胞中的表達(dá)及作用機(jī)制.pdf

1、癲癇是臨床上常見(jiàn)的慢性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要癥狀是反復(fù)突然發(fā)作意識(shí)喪失伴抽搐，嚴(yán)重可伴有腦水腫、心臟損害等全身各器官及系統(tǒng)及損傷。這是由于正常情況下腦通過(guò)自主神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)心臟活動(dòng)，神經(jīng)系統(tǒng)功能異常時(shí)，腦對(duì)心臟的調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常，引發(fā)心臟損害，這種情況在臨床上被稱(chēng)作腦心綜合征（Brain-Heart Syndrome，BHS）。各種引起顱內(nèi)壓增高的疾病均可引起腦心綜合征改變（又稱(chēng)腦源性心臟損害），常見(jiàn)的疾病有癲癇、急性顱腦損傷、急性腦血管病、

2、顱內(nèi)炎癥、顱內(nèi)腫瘤及其它各種顱內(nèi)疾患。據(jù)目前統(tǒng)計(jì)所知，引發(fā)腦心綜合征的最常見(jiàn)病因之一是顳葉癲癇，在我國(guó)，癲癇發(fā)病人數(shù)每年約為人口的25.3/10萬(wàn)，并且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，以世界性常見(jiàn)、多發(fā)癲癇病為例，其中多數(shù)病例可出現(xiàn)心率加快，甚至出現(xiàn)心臟驟停導(dǎo)致死亡。因此，腦心綜合征的研究，對(duì)于臨床的治療具有重要意義。鈣敏感受體（CaSR）的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識(shí)到Ca2+同樣可以作為細(xì)胞外第一信使發(fā)揮類(lèi)似激素的作用。鈣敏感受體(CaSR)是屬于G蛋白偶聯(lián)受體C

3、家族成員，由Brown EM等人在1993年首先從牛甲狀旁腺克隆出來(lái)，隨后發(fā)現(xiàn)甲狀腺、腸道、腎臟、肝臟及中樞神經(jīng)等組織及器官中也有鈣敏感受體廣泛存在，2003年Wang等人首次在大鼠心肌組織中發(fā)現(xiàn)CaSR表達(dá)。研究表明，CaSR可以識(shí)別細(xì)胞外Ca2+的細(xì)微變化，并保證時(shí)刻調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)在維持機(jī)體Ca2＋穩(wěn)態(tài)和其它金屬離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且參與調(diào)節(jié)激素分泌，細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因表達(dá)，離子通道開(kāi)放等過(guò)程。2012年，郭

4、津人等證實(shí)，CaSR參與了大鼠心肌缺血/再灌注損傷、心肌肥大的發(fā)生。目前，癲癇大鼠心肌細(xì)胞中 CaSR表達(dá)及其作用通路情況尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的：通過(guò)觀察戊四氮誘導(dǎo)的慢性癲癇大鼠模型的心肌細(xì)胞中CaSR表達(dá)，證明癲癇大鼠心肌細(xì)胞中有CaSR表達(dá)及其在細(xì)胞凋亡中與線粒體的關(guān)系。
　　方法：清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠，體重180±10克，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分為正常組（control group，n=12)，癲癇

5、組（epilepsy group，n=12)。癲癇組采用連續(xù)28天腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮生理鹽水注射液35mg/ kg.d（pentetrazole PTZ)，建立慢性癲癇大鼠模型。注射后觀察抽搐發(fā)作情況，記錄癲癇發(fā)作的級(jí)別、發(fā)作潛伏期(s)(即注入 PTZ到首次癇性發(fā)作之間經(jīng)歷的時(shí)間)及發(fā)作持續(xù)時(shí)間(s)，凡出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以上癇性發(fā)作的大鼠為模型制備成功（癲癇大鼠行為分級(jí)按 Racine分級(jí)法）。腦電圖檢測(cè)大腦異常放電情況。心臟彩超檢測(cè)心

6、率、左心室縮短分?jǐn)?shù)和左室射血分?jǐn)?shù)。采用德國(guó)臨床化學(xué)學(xué)會(huì)（DGKC）推薦法檢測(cè)血清肌酸激酶(CK)、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）。HE染色觀察心肌形態(tài)學(xué)變化；電鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu)變化。Western bloting分別觀察心肌CaSR、Bcl-2、Caspase3和Bax的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：腦電檢查正常組未見(jiàn)異常變化，癲癇組腦電圖可見(jiàn)明顯節(jié)律失調(diào)，可見(jiàn)尖波及棘波改變，提示癲癇組造模成功。經(jīng)胸高頻超聲心動(dòng)圖能清晰顯示大鼠的

7、左室長(zhǎng)軸切面，正常組心率348次/分，M型曲線顯示左室壁節(jié)律規(guī)整，癲癇組大鼠心率461次/分，M型曲線顯示左室壁節(jié)律失調(diào)。左心室縮短分?jǐn)?shù)（FS）正常值35％-84%，正常組及癲癇組處于正常范圍之內(nèi)；左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）正常值55%-65%，正常組結(jié)果處于正常范圍，癲癇組EF值降低。血清酶結(jié)果顯示，癲癇組CK、CK-MB檢測(cè)結(jié)果高于正常組（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠心肌細(xì)胞在光鏡下觀察：正常組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核及橫紋清楚；癲

8、癇組見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，橫紋不清，并見(jiàn)肌節(jié)的攣縮，部分細(xì)胞胞漿溶解消失，可見(jiàn)液化性壞死，部分細(xì)胞心肌纖維溶解，出現(xiàn)凝固性帶狀壞死，部分細(xì)胞核碎裂消失。在透射電鏡下見(jiàn)正常組心肌細(xì)胞的肌絲排列規(guī)則,橫紋清晰，細(xì)胞核完整，線粒體豐富且嵴密集。癲癇組肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，橫紋模糊，線粒體嵴部分呈溶解狀態(tài)，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集化。證明癲癇組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死及凋亡，線粒體部分損傷明顯。Western bloting方法檢測(cè)CaSR、Bax、Bcl-2和C

9、aspase-3蛋白表達(dá)癲癇組心肌中 CaSR表達(dá)高于正常組（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癲癇組的Bcl-2蛋白表達(dá)低于正常組（P＜0．05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癲癇組Caspase-3的蛋白表達(dá)明顯高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癲癇組 Bax的蛋白表達(dá)明顯高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用PTZ點(diǎn)燃癲癇大鼠模型目前應(yīng)用最為廣泛，連續(xù)28天腹腔注射 PTZ后，癲癇組大鼠顯示連續(xù)出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以上癲癇發(fā)作，同時(shí)觀察到腦電圖出現(xiàn)節(jié)律異常，并可見(jiàn)尖波及

10、棘波的出現(xiàn)，證明造模成功。癲癇組大鼠心臟彩超下見(jiàn)心率明顯增快，左室射血分?jǐn)?shù)降低，證明癲癇組出現(xiàn)心臟損害改變。血清酶檢測(cè)中CK及CK-MB是提示心肌損傷的早期標(biāo)志物，對(duì)心肌損傷具有高特異性及高靈敏性的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)癲癇組CK及CK-MB結(jié)果較正常組明顯增高（p<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合心肌組織鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核碎裂；電鏡下見(jiàn)橫紋模糊，線粒體嵴部分呈溶解狀態(tài)，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集化，充分證明癲癇組存在心肌損害

11、及心肌細(xì)胞凋亡改變。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，PTZ誘導(dǎo)癲癇可導(dǎo)致大鼠心肌損傷，心肌組織中CaSR表達(dá)增加，CaSR激活后并通過(guò)線粒體內(nèi)源性途徑，激活 Cyt-C-Caspase3途徑參與細(xì)胞凋亡有關(guān)，并且證明，CaSR激活可抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)，激活促凋亡 Bax蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CaSR的表達(dá)上調(diào)可增加心肌損傷的易感性，因此，下調(diào)CaSR的表達(dá)，對(duì)于癲癇患者的心肌保護(hù)，預(yù)防腦心綜合癥是進(jìn)一步研究的重