戊四氮點燃癲癇大鼠學習記憶改變及GAP-43的表達變化.pdf

1、目的:臨床發(fā)現(xiàn)30％～40％的癲癇患者除癲癇反復發(fā)作癥狀外,常伴有記憶力減退、注意力分散、情感行為異常及社會適應能力下降等多種認知功能受損的表現(xiàn),嚴重影響了患者的生存質量。癲癇與認知功能損害的關系已引起人們廣泛重視,并已經成為現(xiàn)代癲癇病學研究的熱點之一,然而癲癇對認知功能損害的確切機制還不清楚。一般認為,基礎病因和常用的抗癲癇藥物的副作用是引起認知功能損害的誘因,近些年研究表明,癇性發(fā)作本身也是癲癇患者認知損害的主要原因。本實驗通過腹腔

2、注射戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)建立起穩(wěn)定的慢性癲癇實驗動物模型并給予NMDA受體拮抗劑美金剛(memantine,MMT)加以干預,應用Morris水迷宮觀察癲癇大鼠學習記憶變化,利用免疫組化及RT-PCR方法檢測GAP-43蛋白及轉錄水平的變化,并進一步研究美金剛對學習記憶的改善作用,探討癲癇后認知功能障礙的分子機制。
　　 方法:選用健康雄性SD大鼠,經兩次Y-迷宮篩選合格后獲得110只大鼠,隨機

3、分五組,NC組(20只)大鼠每日腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共44d。PTZ組(30只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共14 d。PTZ+MMT(5)組(20只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min分別腹腔注射MMT5 mg/kg,共14d。PTZ+MMT(10)

4、組(20只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min分別腹腔注射MMT10mg/kg,共14d。PTZ+MMT(15)組(20只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min分別腹腔注射MMT15mg/kg,共14d。造模成功后采用Morris水迷宮進行大鼠學習和記憶成績的測試。運用反轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法和

5、免疫組化方法分別測定大鼠NC組和PTZ組海馬GAP-43 mRNA和蛋白的水平變化。
　　 結果:
　　 1、行為學觀察PTZ組大鼠在注射PTZ后第3～7天起開始出現(xiàn)凝視、點頭、反復洗臉動作、面部及頭部抽搐等,以后發(fā)作癥狀逐日加重,于給藥第16～24天出現(xiàn)全身肌陣攣、雙前肢抬起,跌倒,最終發(fā)生全身強直-陣攣性發(fā)作,達到RacineⅣ～Ⅴ級的點燃標準,每次強直-陣攣發(fā)作持續(xù)數分鐘到數十分鐘不等。大鼠連續(xù)三次RacineⅣ～

6、Ⅴ級發(fā)作后被認為點燃成功,共有大鼠24只完全點燃。PTZ+MMT(5)組:應用PTZ30天時大鼠表現(xiàn)同單純PTZ組,共有15只大鼠完全點燃;后14天PTZ注射前給予MMT,大鼠癲癇發(fā)作Ⅳ～Ⅴ級程度基本未變,但發(fā)作持續(xù)時間和發(fā),作后緩解時間均縮短。PTZ+MMT(10)組:應用PTZ30天時大鼠表現(xiàn)同單純PTZ組,共有16只大鼠完全點燃;后14天PTZ注射前給予MMT,大鼠癲癇發(fā)作Ⅳ～Ⅴ級程度基本未變,但發(fā)作持續(xù)時間和發(fā)作后緩解時間均縮短

7、。PTZ+MMT(15)組:應用PTZ30天時大鼠表現(xiàn)同單純PTZ組,共有14只大鼠完全點燃;后14天PTZ注射前給予MMT,大鼠癲癇發(fā)作Ⅳ～Ⅴ級程度基本未變,但發(fā)作持續(xù)時間和發(fā)作后緩解時間均縮短,但有2只死亡。NC組無癲癇發(fā)作表現(xiàn)。
　　 2、Morris水迷宮檢測結果
　　 定位航行實驗結果:每日逃避潛伏期取其平均值進行比較,結果顯示(1)實驗第1天,五組大鼠逃避潛伏期比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);(2)實驗第2

8、天,各組逃避潛伏期均比第一天明顯縮短,與NC組的逃避潛伏期(14.36±4.09)s比較,PTZ組大鼠的逃避潛伏期(23.85±5.66)s明顯延長(P＜0.01),PTZ+MMT(5)組(20.90±5.84)s和PTZ+MMT(15)組(21.20±5.23)s長于NC組(P＜0.05);PTZ+MMT(10)組的逃避潛伏期(14.97±3.23)s長于NC組,無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);PTZ+MMT(5)和PTZ+MMT(15

9、)長于PTZ+MMT(10),有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(3)實驗第3天,與NC組(8.14±1.38)s比較,PTZ組大鼠的逃避潛伏期(15.51±1.27)s延長(P＜0.01),PTZ+MMT(5),PTZ+MMT(10)和PTZ(15)組分別為(12.35±1.87)s,(9.78±2.23)s,和(14.98±1.54)s比NC組延長(P＜0.05),PTZ+MMT(10)與PTZ+MMT(5)和PTZ+MMT(15)相比

10、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 空間探索試驗結果:PTZ組大鼠60 s內穿越平臺區(qū)域的次數(2.37±0.60)明顯低于NC組(5.17±1.39)(P＜0.01);PTZ+MMT(5)組和PTZ+MMT(15)組分別為(3.52±1.09)和(3.40±0.47)低于NC組(P＜0.05);PTZ+MMT(10)組為(4.68±1.28)雖低于NC組,無統(tǒng)計學差異;PTZ組與PTZ+MMT(10)相比,有統(tǒng)計學差異(P＜

11、0.01),與PTZ+MMT。(5)和PTZ+MMT(15)無統(tǒng)計學差異;
　　 在平臺象限的游泳時間為:NC組(23.57±4.75)s,PTZ組(18.58±1.52)s,PTZ+MMT(5)(19.67±3.34)s,PTZ+MMT(10)組(22.64±3.25)s,PTZ+MMT(15)組(19.27±2.26)s四組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3、GAP-43 mRNA的表達PTZ組大鼠海馬GA

12、P-43 mRNA/β-actin mRNA表達(0.591±0.075)與NC組(0.817±0.051)相比降低,兩者有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4、采用免疫組化方法檢測PTZ組和NC組標本大鼠GAP-43蛋白在海馬CA1區(qū)和DG區(qū)表達
　　 NC組大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)可見彌散分布的GAP-43免疫反應產物,為細小的棕褐色顆粒,神經元胞膜染色最深,呈棕黃色,斑點狀。PTZ組大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)亦可見

13、散在分布的GAP-43免疫反應產物,與NC組相比,陽性神經元數量明顯減少,而且染色較淺。
　　 結論:
　　 1、本實驗建立的戊四氮點燃慢性癲癇大鼠模型存在學習和記憶能力缺損,表現(xiàn)為逃避潛伏期延長,穿越平臺次數減少和平臺象限游泳時間無明顯改變,美金剛可以改善大鼠的學習記憶障礙,以10mg/kg最佳。
　　 2、與對照組比較,戊四氮慢性點燃癲癇組大鼠海馬神經GAP-43mRNA轉錄水平下降,在海馬CA1和DG區(qū)免疫