戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬p53的表達(dá)變化.pdf

1、目的：癲癇是以腦部神經(jīng)元過度放電所致的突然反復(fù)發(fā)作和暫時(shí)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的一種常見的臨床綜合征。癲癇發(fā)作后腦組織內(nèi)各種酶、神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸等化學(xué)物質(zhì)水平迅速變化，可致腦損傷，并與凋亡相關(guān)基因共同作用促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但目前對癲癇后細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不清楚。p53基因是一種重要的抑癌基因，近年來發(fā)現(xiàn)，p53基因與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。本研究通過腹腔注射戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）建立癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠

2、模型（status epilepticus，SE），采用免疫組織化學(xué)、反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）以及Western Blot方法來檢測癲癇發(fā)作大鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞不同時(shí)間的p53表達(dá)變化，探討凋亡相關(guān)基因P53在癲癇發(fā)病中的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究癲癇發(fā)病后的凋亡機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：選取清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠120只，實(shí)驗(yàn)起始質(zhì)量200±20g，12h光亮/黑暗條件、22℃～25℃環(huán)境溫度

3、，分籠喂養(yǎng)。隨機(jī)分為癲癇持續(xù)狀態(tài)組（status epilepticus，SE組）100只，再分為致癇后1、6、24、48、72小時(shí)五個(gè)亞組，每組20只，正常對照組（normal control group，NC組）20只。SE組大鼠應(yīng)用生理鹽水溶解的1％PTZ溶液，首先按40mg/kg腹腔注射，10min后20mg/kg腹腔注射，之后每10min腹腔注射10mg/kg，依據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)，0級：無任何反應(yīng)；Ⅰ級：胡須動(dòng)、面肌抽動(dòng)

4、；Ⅱ級：點(diǎn)頭、咀嚼或濕狗樣抖動(dòng)（wet dog shakes，WDS）；Ⅲ級：一側(cè)前肢抬起、陣攣；Ⅳ級：站立伴有雙側(cè)前肢陣攣；Ⅴ級：跌倒、全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作，SE大鼠模型成功標(biāo)準(zhǔn)：運(yùn)動(dòng)驚厥達(dá)Ⅳ級或以上為誘發(fā)成功，且反復(fù)發(fā)作達(dá)30min以上。NC組大鼠在相同時(shí)間給予同等容量、同等次數(shù)的生理鹽水。行為學(xué)觀察后，各組大鼠均選取12只運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法和Western Blot方法分別測定大鼠海馬p53 mRNA和蛋白的

5、水平變化，免疫組織化學(xué)方法觀察p53在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.行為學(xué)觀察。SE組大鼠共100只，其中16只腹腔注射PTZ 40mg/kg，54只注射60mg/kg，25只注射70mg/kg，5只注射80mg/kg。開始發(fā)作后，首先出現(xiàn)點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、尾巴翹起，繼而節(jié)律性縮頭、雙側(cè)前肢抬起、肌陣攣，隨著PTZ每10min注射一次，最終發(fā)展為全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，四肢強(qiáng)烈抽搐，伴有跌倒、翻滾及流

6、涎，達(dá)到RacineⅣ～Ⅴ級的點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，每次發(fā)作數(shù)分鐘不等，且反復(fù)發(fā)作，持續(xù)在30min以上，達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)。其中有34只大鼠因發(fā)作抽搐過強(qiáng)、時(shí)間持續(xù)長而死亡，死亡率為34％，NC組大鼠均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。
　　 2.大鼠海馬組織p53 mRNA的表達(dá)。SE后6h，p53mRNA表達(dá)開始增高（P<0.01），24h達(dá)高峰（P<0.001），48h表達(dá)略有下降（P<0.05），72h后下降明顯（P<0.01），但仍高于對照組。

7、
　　 3.大鼠海馬組織p53蛋白的表達(dá)。注射戊四氮大鼠出現(xiàn)SE后6h，海馬p53蛋白表達(dá)開始增加（P<0.05），與對照組相比兩SE后24h海馬p53蛋白表達(dá)達(dá)高峰（P<0.001），48h蛋白表達(dá)略下降（P<0.01）。大鼠海馬p53蛋白表達(dá)變化與p53 mRNA相吻合。
　　 4.p53蛋白免疫組化表達(dá)的結(jié)果。注射戊四氮大鼠出現(xiàn)SE后6h，海馬p53蛋白表達(dá)開始增加，海馬CA1區(qū)有微弱表達(dá)（P<0.05），24h后

8、海馬p53蛋白表達(dá)達(dá)高峰（P<0.001），海馬CA1、CA3區(qū)均可見明顯表達(dá)。p53蛋白陽性細(xì)胞主要分布在海馬錐體細(xì)胞核，呈棕褐色。在NC組大鼠海馬錐體細(xì)胞核未見明顯p53蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1.腹腔注射戊四氮可成功誘導(dǎo)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，是模擬全身強(qiáng)直一陣攣性癲癇發(fā)作的一種理想模型。
　　 2.戊四氮誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)后，大鼠海馬p53mRNA及其蛋白的表達(dá)于6h開始增高，24h達(dá)高峰