橡膠草HMGR基因的克隆及功能分析.pdf

1、目的：天然橡膠是一種特殊品質的生物聚合物，而不能被人工合成的橡膠所取代，天然橡膠的生物合成是通過產膠植物的類異戊二烯代謝途徑進行的，例如橡膠樹、杜仲、銀膠菊、橡膠草（又稱俄羅斯蒲公英）等等。其中橡膠草一直以來被認為是低成本的潛在橡膠替代來源，他們生長周期短、遺傳轉化體系完善。在他們的根部可以合成高質量的天然橡膠，而改良后的橡膠草就是一種更具有經濟價值可持續(xù)利用的產膠草本植物，因此在橡膠生產行業(yè)是一種有發(fā)展前景和可以商業(yè)化的資源。本研究主

2、要是通過在橡膠草中過量表達 HMGR基因來控制橡膠草甲羥戊酸代謝途徑中的異戊烯焦磷酸的合成，進而研究該基因在產膠代謝中的作用。因此橡膠草是研究植物產膠機理的良好模式植物，其乳管也可以作為產膠功能基因鑒定平臺，是具有發(fā)展前途的產膠植物。
　　方法：本研究在優(yōu)化的橡膠草再生體系的基礎上，分別以橡膠草cDNA和橡膠樹的DNA為模板，克隆橡膠草HMGR基因和橡膠樹HMGR1基因的特異性啟動子HbHMGR基因，對HMGR基因進行了生物信息學

3、分析。構建原核表達載體，轉化BL21菌株并誘導表達；構建細胞融合表達載體，轉化GV3101菌株并侵染洋蔥表皮細胞，在共聚焦顯微鏡下觀察基因表達情況；構建植物過表達載體，通過農桿菌介導法轉入橡膠草，獲得轉基因植株，轉基因植株分子檢測的結果表明外源基因已經整合到橡膠草基因組中，并對轉基因橡膠草進行了基因表達量分析。
　　結果
　?。?）克隆獲得橡膠草 HMGR基因和橡膠樹 HMGR1基因的特異性啟動子HbHMGR1基因， HMG

4、R基因含有一個1749bp大小的開放閱讀框，編碼582個氨基酸，HMG-CoA還原酶屬于HMG-CoA還原酶超家族中的一員；
　?。?）構建原核表達載體，經IPTG誘導和SDS-PAGE檢測，HMGR蛋白在BL21菌株中成功表達，分子量為62.6591KDa，當誘導6h時表達量最高；
　?。?）構建細胞融合表達載體，亞細胞定位結果顯示，HMGR-GFP融合蛋白主要定位于細胞膜和核膜上；
　?。?）對橡膠草的再生體系優(yōu)化

5、的結果表明，以橡膠草的葉柄作為外植體，誘導不定芽的激素配比為1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA，不定芽生根的激素配比為0.1mg/L NAA；
　?。?）構建植物過表達載體 pCAMBIA2300-35S-TkHMGR和pCAMBIA-1303-HbHMGR1-TkHMGR，采用農桿菌介導法侵染橡膠草莖，經PCR鑒定獲得轉基因橡膠草，對獲得的轉基因橡膠草進行Real Time-PCR分析，表明外源基因隨機整合到橡膠草的基因