褐藻多酚Eckol抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　觀察褐藻多酚Eckol的抗腫瘤作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為Eckol在腫瘤防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、Eckol的抗腫瘤作用研究:分別建立移植型S180腹水瘤及肉瘤荷瘤小鼠模型，造模前預(yù)防性給予生理鹽水或Eckol(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)7天。S180腹水瘤小鼠模型造模后繼續(xù)給藥15天，每天記錄小鼠活動(dòng)狀態(tài)，記錄小鼠生存天數(shù)。S180肉瘤荷瘤小鼠模型造模

2、后繼續(xù)給藥10天，每天記錄小鼠體重，記錄小鼠生長曲線，最后一次給藥1h后，處死小鼠，分離脾臟和胸腺，計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù);剝?nèi)∪饬鼋M織，稱重;HE染色觀察腫瘤組織病理變化;TUNEL染色檢測腫瘤細(xì)胞凋亡;以Western blot法測定瘤組織EGFR、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平。
　　2、Eckol對S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能的影響:建立移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型，造模前預(yù)防性給藥7天，造模后繼續(xù)給藥10天。取

3、小鼠外周血血清，ELISA法檢測IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平;以碳粒廓清法了解小鼠外周血單核-吞噬細(xì)胞的吞噬功能;取外周血，流式細(xì)胞術(shù)測定小鼠外周血T細(xì)胞亞群分布;分離小鼠脾臟，磨碎后過濾、種板，ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化，MTT法檢測Eckol對脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響;免疫組化法測定CD11c陽性細(xì)胞在腫瘤組織中的分布，了解腫瘤組織樹突狀細(xì)胞浸潤情況;從小鼠骨髓中獲得小鼠骨髓來源的單核細(xì)胞，用含IL-4和GM-

4、CSF20ng/ml的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞。收集細(xì)胞，流式三標(biāo)法(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)檢測髓源性樹突狀細(xì)胞表型。
　　3、Eckol對Reg3A誘導(dǎo)人胰腺癌SW1990細(xì)胞過度增殖的影響:體外培養(yǎng)SW1990細(xì)胞，Eckol（0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）處理細(xì)胞48h，加入50ng/ml的外源性Reg3A蛋白共處理24h后，MTT法檢測細(xì)胞存活率。選取Ecko

5、l（5、10、20μg/ml）三個(gè)濃度組，Eckol處理細(xì)胞48h后，50ng/ml外源性Reg3A蛋白共處理24h，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期;軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力;Real Time PCR法檢測JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA表達(dá);Western blot法檢測JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、NF-κB、Cyclin D1蛋白水平表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、

6、Eckol的抗腫瘤效應(yīng):Eckol體內(nèi)干預(yù)可延長移植型S180腹水瘤荷瘤小鼠生存天數(shù);移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型中，Eckol呈劑量依賴性地降低肉瘤重量，升高脾指數(shù)，且不明顯改變動(dòng)物生存曲線。腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示，Eckol處理組中，肉瘤組織微血管減少，壞死增加，核固縮明顯，癌巢周圍發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤。TUNEL染色結(jié)果顯示，Eckol處理組腫瘤細(xì)胞凋亡增加。腫瘤組織內(nèi)凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)上升，抑凋亡蛋白Bcl-2和增殖

7、相關(guān)蛋白EGFR表達(dá)下降。提示Eckol體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)明顯。
　　2、Eckol對移植型S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能具有顯著調(diào)節(jié)作用:ELISA結(jié)果顯示，Eckol處理組S180肉瘤荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ顯著升高，提示Eckol能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，促進(jìn)Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫;此外，Eckol提高荷瘤小鼠外周血單核-吞噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)外周血T細(xì)胞亞群比例。免疫組化及流式

8、結(jié)果顯示，Eckol能夠促進(jìn)腫瘤組織樹突狀細(xì)胞的浸潤，且影響樹突狀細(xì)胞表型，促進(jìn)髓源性樹突狀細(xì)胞成熟。提示，Eckol體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)極可能與其對荷瘤小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。
　　3、Eckol對Reg3A誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞過度增殖的抑制作用:MTT法顯示，5-20μg/ml Eckol對SW1990細(xì)胞增殖沒有明顯的體外抑制作用，但Eckol+Reg3A與Reg3A單獨(dú)作用相比，細(xì)胞存活率下降。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，與Reg3

9、A單獨(dú)作用相比，Eckol+Reg3A組S期和G2/M期細(xì)胞減少，G0/G1期細(xì)胞增多。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Eckol+Reg3A組的克隆數(shù)比Reg3A組克隆數(shù)明顯減少。Real Time PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Reg3A可以上調(diào)JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA及蛋白的表達(dá)水平，而Eckol可濃度依賴性地抑制這些上調(diào)作用。提示，Eckol體外對Reg3A誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞過度增殖

10、具有抑制作用，其機(jī)制可能與JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信號通路相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、Eckol具有顯著抗腫瘤效應(yīng)，其體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的發(fā)揮可能與其調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能密切相關(guān)。
　　2、Eckol體外可抑制胰腺炎癥相關(guān)介質(zhì)Reg3A蛋白誘導(dǎo)的胰腺癌SW1990細(xì)胞過度增殖，提示Eckol對伴隨炎癥的胰腺癌的惡性進(jìn)展具有潛在的抑制效應(yīng)，其機(jī)制可能與JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin