利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)定向改良水稻兩個品質(zhì)性狀.pdf

1、在我國水稻育種中，品質(zhì)改良已成為了攻關(guān)的熱點(diǎn)。在水稻品質(zhì)性狀中，糯性和香味是水稻的特殊品質(zhì)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展和成熟為糯性和香味的改良提供了高效的技術(shù)手段。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，分別針對雜交水稻親本材料209B和Y58S進(jìn)行糯性和香味的改良，分別對負(fù)調(diào)控直鏈淀粉含量基因Wx和稻米香味基因Badh2進(jìn)行定點(diǎn)基因編輯，獲得新型的優(yōu)良雜交水稻親本材料。有關(guān)研究結(jié)果如下:
　　1、水稻材料20

2、9B中的Wx位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，針對Wx基因選擇合適的靶位點(diǎn)，參與構(gòu)建sgRNA表達(dá)盒，并pYLCRISPR/Cas9載體連接;單靶點(diǎn)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻材料209B;對T0、T1代轉(zhuǎn)化植株定點(diǎn)編輯位置進(jìn)行PCR檢測和測序分析，分別測定轉(zhuǎn)化植株精米直鏈淀粉含量，篩選出無外源轉(zhuǎn)化元件的純合突變體。結(jié)果表明，T0代209B突變材料中Wx位點(diǎn)的突變頻率高達(dá)66.7％，其中純合缺失突變率表型為直鏈淀粉在4％以下占33.3％;
　　2、

3、水稻材料Y58S中的Badh2位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，針對Badh2基因選擇合適的靶位點(diǎn)，參與構(gòu)建sgRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9載體連接;雙靶點(diǎn)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻材料Y58S;對T0、T1代轉(zhuǎn)化植株定點(diǎn)編輯位置進(jìn)行PCR檢測和測序分析，分別鑒定轉(zhuǎn)化植株是否含有香味物質(zhì)，再對T0、T1代突變植株進(jìn)行遺傳分析，T0代純合突變植株能穩(wěn)定地遺傳給T1代植株中，T0代雙等位突變植株在遺傳過程中符合孟德爾遺傳定律，并且在突變植株遺

4、傳分離過程中可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得沒有外源基因元件的T-DNA-free突變體植株。結(jié)果表明，T0代Y58S突變材料中Badh2位點(diǎn)的突變頻率高達(dá)69.7％，其中純合缺失突變率表型為轉(zhuǎn)化植株有強(qiáng)烈香味的占31.3％;
　　3、對T1代T-DNA-free純合突變體的調(diào)查分析結(jié)果表明:多數(shù)Wx基因突變體能顯著降低直鏈淀粉含量，所獲得的209B水稻T1代純合突變體材料直鏈淀粉含量僅1％，糯性品質(zhì)優(yōu)良，其他主要農(nóng)藝性狀、經(jīng)濟(jì)性狀與