IBDV急性感染階段雞免疫抑制性受體及細(xì)胞因子的表達(dá)變化初步研究.pdf

1、PD-1與其配體PD-Ls屬于 B7-CD28超家族，最早在 T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)研究中發(fā)現(xiàn)。PD-1與PD-Ls結(jié)合后介導(dǎo)的抑制信號對T細(xì)胞的活化和耐受有重要的調(diào)節(jié)作用。阻斷PD-1與其配體（PD-Ls）的結(jié)合可以使病毒持續(xù)性感染時功能障礙或衰竭的CD8+ T細(xì)胞功能恢復(fù)。PD-1:PD-Ls通路能夠在中樞免疫和外周免疫反應(yīng)中傳遞免疫耐受和免疫抑制信號，控制著細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生、CTL的增殖活化及對自身抗原的耐受。在動物免疫抑制

2、性疾病或病毒持續(xù)性感染方面，T細(xì)胞免疫抑制性受體PD-1的研究才剛剛起步，特別是在家禽類該方面的研究還少見報道。
　　本課題以 IBDV感染后 T淋巴細(xì)胞表面免疫抑制性受體 PD-1及其配體PD-Ls為對象，研究其表達(dá)變化情況及其與機體免疫狀態(tài)的關(guān)系。根據(jù)GenBank中雞PD-1、PD-L1、PD-L2、IL-2、IL-6、IFN-γ以及參考基因β-actin的序列信息，分別設(shè)計特異引物擴增目的基因片段，得到各自陽性克隆質(zhì)粒，以

3、陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行敏感性、特異性和重復(fù)性試驗，建立上述基因的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR檢測方法。并利用所建立的方法對4周齡健康雛雞人工感染IBDV后第3、5、7、10天PBMC中PD-1及其配體PD-L1、PD-L2的表達(dá)變化情況進(jìn)行檢測，同時檢測了與機體免疫調(diào)控相關(guān)的重要細(xì)胞因子IL-2、IL-6和IFN-γ的表達(dá)變化情況。分析在IBDV感染后，病毒在機體內(nèi)的復(fù)制、增殖與PD-1、PD-L1和

4、PD-L2表達(dá)變化之間的關(guān)系。
　　結(jié)果表明，建立的SYBR Green I實時熒光定量 RT-PCR檢測方法在1×101～1×109 copies/μL模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可檢測至少101 copies/μL的陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品，且具有較好的特異性和重復(fù)性。IBDV感染后，病毒在雛雞體內(nèi)復(fù)制逐漸增加，至第5天病毒載量達(dá)到峰值，隨后逐漸降低。免疫抑制性受體實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，PD-1及配體PD-L1、PD-L

5、2在病毒感染后表達(dá)量均有所升高，其中PD-1在病毒感染后第7-10天升高顯著，PD-L1、PD-L2均在病毒感染后第3-10天顯著升高（PD-L1， P<0.01;PD-L2，P<0.05）。病毒感染后部分免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子檢測結(jié)果表明，在IBDV急性感染期（3-7d）IFN-γmRNA表達(dá)水平表達(dá)水平持續(xù)增高，當(dāng)PD-1表達(dá)增高后（7天），IFN-γ表達(dá)水平開始急劇下降且變化顯著。IL-2和IL-6 mRNA表達(dá)水平都在IBDV感染

6、后第3天急劇升高，隨著感染的持續(xù)，IL-2和IL-6 mRNA表達(dá)水平持續(xù)降低（5-10天）。
　　本研究成功建立了雞PD-1及配體PD-L1、PD-L2和細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ實時熒光定量RT-PCR檢測方法。應(yīng)用該方法初步分析了IBDV感染后雞PD-1、PD-L1、PD-L2及細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)IBDV感染后，PD-1及配體PD-L1、PD-L2的表達(dá)均升高，且PD-L1、P