人全血細胞因子在免疫抑制狀態(tài)評估中的應用.pdf

1、背景
　　 器官移植術后病人和自身免疫性疾病患者都常規(guī)使用免疫抑制劑治療,同時相當一部分腫瘤患者需要接受放療或者化療。這些治療方案對患者的免疫系統(tǒng)有很強的抑制作用,這就不可避免的帶來了一個重要問題:如何合理使用免疫抑制劑、制定放療或化療方案? 一方面如果免疫抑制劑使用不足可能導致移植器官的排斥,或者自身免疫性疾病加重；另一方面如果免疫抑制劑使用過度或者放療、化療過量,使患者免疫系統(tǒng)功能被過度抑制,則可能引發(fā)嚴重的感染。目前,器官

2、移植術后和自身免疫疾病死亡病人中,有相當一部分是由于免疫抑制劑使用過度繼發(fā)嚴重感染造成。因此如何合理使用免疫抑制劑,制訂合適的放療、化療方案是目前臨床急需解決的一大難題。而造成這一難題的主要因為是目前沒有一種快速有效的辦法能夠評估患者的免疫狀態(tài),因而無法準確的判斷免疫抑制劑或者放療化療方案使用是否合理。
　　 細胞因子由機體免疫細胞分泌,是機體免疫系統(tǒng)功能的執(zhí)行者和體現(xiàn)者,細胞因子的水平很大程度上反映了機體免疫系統(tǒng)的狀態(tài)。因此我

3、們可以通過評估機體的細胞因子水平來反映機體的免疫狀態(tài),從而指導臨床醫(yī)生合理用藥。
　　 在細胞因子檢測方面,我們選取先進的液態(tài)懸浮芯片技術作為細胞因子的檢測方法。此方法可同時檢測一份樣本中多達100種細胞因子的含量。
　　 目的
　　 1.找到適合的免疫刺激劑,能夠快速有效地刺激全血免疫細胞分泌細胞因子。
　　 2.通過體外實驗,研究不同免疫抑制劑對細胞因子的抑制作用,總結出不同免疫抑制劑特異性的細胞因子

4、譜。
　　 3.進一步收集臨床腎移植病人血樣本,總結出不同免疫狀態(tài)(移植物存活良好,移植物排斥,感染等)下病人細胞因子的變化規(guī)律,建立不同免疫狀態(tài)下的細胞因子譜,用于評估患者免疫狀態(tài)。
　　 方法
　　 1.實驗樣本的選擇
　　 以往實驗多選用稀釋的全血或者分離的單個核細胞作為研究對象,我們進行體外實驗的目的是為了更好的模擬機體的內環(huán)境,因此我們選擇未稀釋的肝素化全血作為我們的研究樣本,更好的模擬全血細胞

5、所處的內環(huán)境。
　　 2.免疫刺激劑的選擇
　　 我們比較不同免疫刺激劑刺激全血細胞分泌細胞因子的能力。對比 PHA 和PMA+IONO 刺激全血細胞分泌細胞因子的變化。進一步找出PMA+IONO刺激全血細胞分泌細胞因子的最佳濃度和最佳刺激時間。
　　 3.不同免疫抑制劑以及同一免疫抑制劑不同濃度條件下細胞因子的變化
　　 加入不同免疫抑制劑與全血共同培養(yǎng)6小時,保證免疫抑制劑與全血細胞充分作用,再加入免

6、疫刺激劑PMA+IONO刺激全血細胞分泌細胞因子,研究不同免疫抑制劑對不同細胞因子的抑制作用,以及同一免疫抑制劑不同濃度條件下抑制作用的變化。
　　 4.免疫抑制劑單用及聯(lián)合運用對細胞因子譜的影響
　　 按照臨床常見的免疫抑制劑組合,MPA+DEX+FK或者MPA+DEX+CsA聯(lián)合使用,比較免疫抑制劑單用和聯(lián)合使用條件下,細胞因子譜的變化規(guī)律。
　　 5.細胞因子檢測方法的選擇
　　 在細胞因子檢測方面

7、,我們需要全面快速分析全血中多種細胞因子,因此傳統(tǒng)的ELISA技術、蛋白質組學技術均無法滿足我們的需求。而液態(tài)懸浮蛋白芯片技術:它將流式檢測與芯片技術有機地結合在一起,最多可以檢測一份樣本中 100 種細胞因子的水平,而且檢測時間短,一次檢測大概花費2小時。因此我們選用通過了美國 FDA 認證的液態(tài)懸浮蛋白芯片技術作為細胞因子的檢測技術。
　　 6.統(tǒng)計學方法
　　 采用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用方差分析進

8、行多組之間的比較,采用 LSD 法(方差齊)或者 Dunnett’s T(方差不齊)進行多組之間的兩兩比較。
　　 結果
　　 1.PMA+IONO 能夠快速有效的刺激細胞因子的分泌,PMA(0.15 μg/ml)+IONO(2.5μg/ml)為刺激細胞因子分泌的最佳刺激濃度。6小時為PMA+IONO刺激細胞因子分泌的最佳時間點。
　　 2.低濃度 DEX(0.1 μg/ml)、中濃度DEX(1 μg/ml)及高

9、濃度 DEX(10 μg/ml)均能抑制的細胞因子:IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IFN-Y,TNF-α,IL-13和GM-CSF。此外,中濃度DEX(1 μg/ml)及高濃度 DEX(10 μg/ml)還能抑制的細胞因子有:G-CSF。
　　 3.低濃度 CsA(0.05μg/ml)、中濃度 CsA(0.25μg/ml)及高濃度 CsA(1.25μg/ml)能抑制的細胞因子:IL-17,IFN-Y,G-CSF 和GM

10、-CSF。中濃度 CsA(0.25μg/ml)及高濃度 CsA(1.25μg/ml)能抑制的細胞因子:IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-13 和TNF-α。
　　 4.低濃度 FK(1ng/ml)不能抑制任何細胞因子,中濃度 FK(5ng/ml)能抑制細胞因子 GM-CSF。高濃度 FK(20ng/ml)能抑制的細胞因子有:IL-2,IL-4,IL-5,IL-10,IL-13,IL-17,IFN-Y,TN

11、F-α 和G-CSF。
　　 5.各個濃度的MPA均無法抑制任何細胞因子的分泌。
　　 6.在 DEX(1μg/ml),FK(5ng/ml)和MPA(10μg/ml)三聯(lián)方案中:
　　 1)IL-2,GM-CSF:同空白組相比,僅三藥聯(lián)用組能夠抑制 IL-2的分泌。
　　 2)IL-4,IL-5,IL-6,IL-13,TNF-α,G-CSF:同空白組相比,DEX 組及三聯(lián)用藥均能抑制這幾種細胞因子的分泌.

12、三聯(lián)用藥組與 FK 組,MPA組細胞因子水平也有統(tǒng)計學差異。
　　 3)IFN-Y:同空白組相比,MPA 組、DEX 組及三聯(lián)用藥均能抑制 IFN-Y的分泌。三聯(lián)用藥組與FK組,MPA組細胞因子水平也有統(tǒng)計學差異。
　　 4)IL-10,IL-17:同空白組相比,單用或聯(lián)用藥物組均無法抑制其分泌。
　　 7.在 DEX(1μg/ml),CsA(0.25μg/ml)和MPA(10μg/ml)三聯(lián)方案中:
　　

13、 1)IL-4,GM-CSF:三聯(lián)用藥組與空白組、MPA 組有統(tǒng)計學差異,因此IL-4,GM-CSF主要反映的是CsA和DEX的協(xié)同作用。
　　 2)IL-5,IL-6,IL-13:三聯(lián)用藥組與空白組、CsA組及MPA組有統(tǒng)計學差異,因此 IL-5,IL-6,IL-13 主要反映的是DEX的作用。
　　 3)IL-10,G-SCF:三聯(lián)用藥組與空白組、DEX 組及 MPA 組有統(tǒng)計學差異,因此 IL-10,G-SCF主

14、要反映的是CsA作用。
　　 4)IL-2,IFN-Y,TNF-α:三聯(lián)用藥組與 CsA、DEX、MPA 三藥單用組均有統(tǒng)計學差異,因此這3個因子反映的是三個免疫抑制劑總體協(xié)同抑制作用。
　　 5)IL-17:各組之間均無統(tǒng)計學差異。
　　 結論:
　　 1.PMA+IONO 能夠更快速有效的刺激全血細胞分泌細胞因子。
　　 2.除 MPA 外,其他免疫抑制劑均能有效的抑制在PMA+IONO 刺激

15、條件下某些全血細胞因子的分泌,不同免疫抑制劑有其特異的細胞因子抑制譜。隨著免疫抑制劑濃度的增高,細胞因子的抑制程度也增高。
　　 3.免疫抑制劑在單用和聯(lián)用條件下,細胞因子譜有一定變化。在 FK,DEX 及 MPA三聯(lián)方案中,我們總結發(fā)現(xiàn):IL-2 主要反映三種藥物的協(xié)同抑制作用；IL-4,IL-5,IL-6,IL-13,IFN-Y,TNF-α,G-CSF 主要反映 DEX的抑制作用；GM-CSF主要反映DEX及FK的協(xié)同抑制作

16、用。在 CsA,DEX 及 MPA三聯(lián)方案中,IL-2,IFN-Y,TNF-α 主要反映三藥聯(lián)用的抑制情況；IL-4,GM-CSF 主要反映 CsA 和DEX的聯(lián)合抑制作用；IL-5,IL-6,IL-13 主要反映 DEX的抑制作用。IL-10,G-CSF 主要反映的是 CsA的抑制作用。從我們總結的結果可以得知,即使在三種免疫抑制劑聯(lián)合使用的情況下,仍然有某些細胞因子特異的反映某一類免疫抑制劑的作用,因此我們可以通過檢測這類細胞因子,