構(gòu)建基因敲除的動物和細胞模型研究cdc42對急性肺損傷肺微血管屏障功能的保護作用.pdf

1、近幾十年來,隨著人口老齡化時代的到來,各種重癥呼吸道疾病患者的發(fā)病率逐年增加。特別是進入二十一世紀以來,各種新型的呼吸道烈性傳染病如SARS、禽流感、H1N1甲型流感等不斷肆虐全球,引起全球大流行,對人類的健康和生產(chǎn)生活造成了嚴重的影響。目前針對這些烈性傳染病有確實療效的藥物有限,對很多重癥患者只能是對癥治療,重癥患者多數(shù)是死于急性肺損傷(Acute Lung Injury ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respirator

2、y DistressSyndrome,ARDS)。除這些烈性呼吸道傳染病外,其它各種呼吸系統(tǒng)疾病的危重患者約有一半以上的病例將會發(fā)展成ALI/ARDS,目前對ALI和ARDS尚無有效的治療措施,常規(guī)是給予高濃度氧、機械通氣、積極治療原發(fā)病、加強監(jiān)護和營養(yǎng)支持等對癥支持治療。雖然機械通氣等呼吸支持技術日益提高,ALI和ARDS病死率仍然高達40％-70％。因此,深入研究ALI和ARDS的發(fā)病機制,尋求有效的治療藥物和治療手段是目前迫切需要

3、解決的問題。
　　 急性肺損傷(Acute Lung Iinjury,ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(AcuteRespiratory Distress Syndrome,ARDS)的早期階段。ALI和ARDS病理特征和重要的發(fā)病機制是廣泛的肺微血管內(nèi)皮細胞的壞死、凋亡及功能失調(diào),導致肺微血管通透性的增加,屏障功能下降,形成肺水腫。深入探索研究肺微血管內(nèi)皮細胞通透性變化的調(diào)控機制,抑制肺微血管通透性的增加、恢復和增強微血管的屏障功

4、能是目前急性肺損傷防治研究的熱點,對于預防和治療急性肺損傷以及其它炎癥和血管相關性疾病具有重要意義。
　　 影響細胞間通透性的主要是細胞間連接,在內(nèi)皮細胞中起主要作用的是黏附連接。對微血管通透性影響最重要的分子是小G蛋白家族,cdc42是小G蛋白家族中重要成員,實驗證實,cdc42可通過增強細胞間連接來增強內(nèi)皮細胞的屏障功能,實驗表明,分別在心臟和肝臟敲除Cdc42基因,可以導致心臟的肥大和肝臟的腫大。
　　 但cdc4

5、2對內(nèi)皮細胞屏障功能的保護作用多數(shù)是限于細胞和分子水平,動物水平的研究鮮有報道。在細胞水平上cdc42對內(nèi)皮細胞屏障功能影響的研究多是用特定的內(nèi)皮細胞,如皮膚的微血管內(nèi)皮細胞、臍靜脈內(nèi)皮細胞等,尚無對肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能的研究,而且對急性肺損傷后肺微血管內(nèi)皮細胞的屏障功能是否具有保護作用,目前尚不清楚,仍有待于進一步的研究。
　　 本實驗擬利用cre/loxp技術,構(gòu)建在全身血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠模型,以及在

6、肺微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的細胞模型,分別從動物水平和細胞水平觀察敲除cdc42基因?qū)Ψ挝⒀軆?nèi)皮細胞屏障功能的影響。同時,利用引進的cdc42GAP基因敲除小鼠(cdc42GAp-/-小鼠),構(gòu)建在全身cdc42持續(xù)活化的小鼠模型,觀察其對急性肺損傷肺微血管通透性的影響。
　　 一、全身血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因小鼠模型的構(gòu)建采用cre/loxp技術,利用從北京軍事醫(yī)學科學院引進的在全身血管內(nèi)皮細胞上表達cre

7、重組酶的小鼠(簡稱Tie2cre+/-小、鼠),以及從美國辛辛那提大學引進的cdc42flor/flox小鼠,通過該兩種小鼠雜交,以及基因型篩選鑒定構(gòu)建在全身血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠模型,在活的出生后的小鼠中,未發(fā)現(xiàn)有全身血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠,考慮可能是敲除該基因后導致小鼠血管和胚胎發(fā)育障礙,不能發(fā)育成成熟小鼠。
　　 二、在全身血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因?qū)π∈笈咛ズ脱馨l(fā)育的影響利用cre

8、/loxp技術,采用Tie2cre+/-小鼠和cdc42flox/flox雜交的方式未能有全身血管內(nèi)皮細胞敲除cdc42基因的小鼠存活,考慮敲除該基因的小鼠在胚胎期間已死亡。為此,擬進一步研究敲除cdc42對小鼠胚胎和血管發(fā)育的影響。。Tie2cre+/-小鼠和cdc42flox/flox小鼠雜交,取基因型為cdc42flox/+Tie2cre+/-子代小鼠與cdc42flox/flox小鼠回交。母鼠懷孕后,取7.5-19.5天胎齡的小

9、鼠胚胎進行基因型的鑒定,并觀察胚胎的大小、外形和發(fā)育的情況,以及針對血管內(nèi)皮細胞特有的CD31抗原而進行的抗CD31抗體免疫組化來顯示血管發(fā)育的情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在胎齡在8.5-13.5天的小鼠胚胎中,cdc42flox/+nTie2cre+/-、cdc42flox/floxTie2cre-/-、cdc42flox/+Tie2cre-/、cdc42flox/floxTie2cre+/-這幾種可能的基因型均存在,并可見cdc42基因敲除

10、的胚胎所特有的200bp條帶,在胎齡14.5天及以上的鼠胚中,未見cdc42基因敲除的胚胎。和野生型小鼠胚胎以及和cdc42flox/flox小鼠胚胎比較,cdc42基因敲除的胚胎體型較小,發(fā)育延遲,各器官的血管稀少,有輕度水腫。提示cdc42基因?qū)ρ芎团咛サ陌l(fā)育有重要影響,對血管內(nèi)皮細胞的通透性也有重要影響。
　　 三、全身血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠對急性肺損傷的影響利用cre/loxp條件性基因敲除技術構(gòu)

11、建血管內(nèi)敲除cdc42基因小鼠,通過基因檢測,未發(fā)現(xiàn)敲除cdc42基因的存活小鼠。但在某些情況下,某種基因敲除的雜合子可能也對生理的各項功能產(chǎn)生影響。在本實驗中,擬觀察血管內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠,在急性肺損傷中對肺組織病理改變和肺微血管通透性的影響。
　　 Cdc42flox/flox小鼠與Tie2Cre+/-小鼠雜交,得到基因型為Cdc42flox/+Tie2Cre+/-子代小鼠和Cdc42 flox/+Tie2Cr

12、e-/-子代小鼠,再取Cde42 flox/+Tie2Cre+/-基因型的子代小鼠與Cdc42 flox/flox小鼠回交,得到基因型為Cdc42 flox/+Tie2Cre+/-、Cdc42flox/+Tie2Cre-/-、Cdc42 flox/flox Tie2Cre-/-三種基因型小鼠,Cdc42 flox/+Tie2Cre+/-為血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠,基因型Cdc42flox/+Tie2Cre-/-小鼠和

13、Cdc42flox/flox Tie2Cre-/-小鼠為對照組,三組小鼠經(jīng)氣道內(nèi)給予LPS造成急性肺損傷模型,分別檢測肺組織損傷病理評分、肺微血管通透系數(shù)、肺濕/干重比等指標,進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三組小鼠的肺病理評分分別為9.25±1.488,9.38±2.387,8.50±0.926,整體均值比較p=0.409。三組小鼠肺微血管通透系數(shù)分別為0.0467±0.0227、0.0494±0.0115、0.0325±0.0105伊文思

14、/肺組織(mg/g),整體均值比較p=0.073。三組小鼠的肺濕干重比值分別為5.77±1.13、6.35±1.20、7.98±2.72,整體均值比較p=0.37。在上述三種指標檢測方面無明顯統(tǒng)計學差異,提示全身血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠對急性肺損傷的屏障功能無明顯影響。
　　 四、構(gòu)建體內(nèi)cdc42持續(xù)活化的小鼠模型并研究cdc42持續(xù)活化對急性肺損傷的影響動物或細胞內(nèi)的cdc42與GDP或GTP結(jié)合存在。C

15、dc42與GDP結(jié)合呈非活化狀態(tài),而與GTP結(jié)合,則變成活化狀態(tài),從而表達cdc42的活性。在負性調(diào)節(jié)因子cdc42 GTP酶活化蛋白(cdc42 GTPase Activating Proteins cdc42GAP)的作用下,cdc42GTP將脫去一個磷酸,形成cdc42-GDP的非活化狀態(tài)[20]。若在動物模型中敲除cdc42GAP基因,則喪失cdc42GAP的作用,cdc42將被持續(xù)活化。
　　 利用引進的cdc42GA

16、P雜合子小鼠,構(gòu)建在全身敲除cdc42基因的小鼠,制成全身過度活化cdc42的小鼠模型,來觀察過度活化cdc42是否對肺損傷具有保護作用。在cdc42GAP-/-小鼠和野生型小鼠分別經(jīng)氣道內(nèi)給予LPS造成急性肺損傷模型,檢測對肺組織病理改變的影響,初步的實驗證實過度活化cdc42對急性肺損傷具有保護作用。
　　 五、構(gòu)建在肺微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的細胞模型,以及觀察敲除該基因后對單層肺微血管內(nèi)皮細胞的影響。
　

17、　 采用Tie2cre+/-小鼠和cdc42flox/flox小鼠雜交的方式構(gòu)建在血管內(nèi)皮內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠,未能有敲除該基因的小鼠存活。則調(diào)整實驗策略,利用腺病毒作為載體,攜帶cre重組酶,感染從cdc42flox/flox小鼠上分離培養(yǎng)的構(gòu)建在肺微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)敲除cdc42基因的細胞模型,給予LPS刺激,制成肺微血管內(nèi)皮細胞急性損傷模型,和野生型肺微血管內(nèi)皮細胞急性損傷模型比較,觀察敲除cdc42對單層肺微血管內(nèi)皮細胞屏

18、障功能和細胞間連接的影響。
　　 肺微血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)以及鑒定工作已完成,從野生型小鼠及從cdc42flox/flox小鼠身上分離培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細胞生長情況無明顯差異,其跨內(nèi)皮細胞電阻也無明顯差異。已完成攜帶cre重組酶的腺病毒載體構(gòu)建的大部分工作,已完成包含cre重組酶全長基因組的穿梭載體的構(gòu)建,已轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌,正進行陽性菌落的挑選。
　　 全文總結(jié):我們擬構(gòu)建血管內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠模型,來研究

19、cdc42對急性肺損傷肺微血管通透性的影響,但血管內(nèi)敲除cdc42基因影響小鼠胚胎和血管的發(fā)育,導致胚胎發(fā)育延遲、血管稀少,胚胎水腫,不能發(fā)育成成熟小鼠,提示cdc42對胚胎和血管的發(fā)育,以及血管的通透性有重要影響。但血管內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠對急性肺損傷無明顯保護作用。利用引進的cdc42GAP基因敲除的雜合子小鼠,構(gòu)建在體內(nèi)過度活化cdc42的小鼠模型,初步證明過度活化cdc42對急性肺損傷具有重要作用?，F(xiàn)正利用攜帶cre