成牙本質(zhì)細胞極性相關(guān)蛋白cdc42和E-cadherin的表達及功能.pdf

1、成牙本質(zhì)細胞是位于牙髓組織最外層的高柱狀細胞,頂端能夠分泌牙本質(zhì)基質(zhì),底端位于牙髓組織內(nèi),是一種典型的極性化細胞。在成牙本質(zhì)細胞的發(fā)生過程中,經(jīng)歷了從無極性化細胞分化發(fā)育成為極性化細胞的過程。該過程的進行同時也伴隨著成牙本質(zhì)細胞的成熟與牙本質(zhì)基質(zhì)的分泌。在細胞頂?shù)讟O性建立過程中,細胞連接的形成和極性蛋白復合物的定位是兩個必要的細胞生物學行為。細胞連接作為相鄰細胞間的錨定結(jié)構(gòu),起到阻隔外來物質(zhì)通透細胞層的作用,同時作為細胞膜分隔條帶,將細

2、胞膜區(qū)域分為頂端和底端。細胞連接的建立也為細胞極性復合物在細胞膜上的定位提供了錨定結(jié)構(gòu),是細胞極性形成的前提。細胞極性復合物的發(fā)生及其在細胞膜特定區(qū)域的定位則是細胞極性形成的分子基礎。極性分子在細胞膜的定位決定了細胞膜相應區(qū)域的功能。同時,細胞連接的建立和極性分子的定位也可以影響細胞器在胞漿內(nèi)的分布。發(fā)育成熟的成牙本質(zhì)細胞,其細胞核位于細胞的底端,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器則朝向細胞的分泌端,即細胞頂端。這種細胞形態(tài)的形成正是其細胞極性化

3、分泌功能的形態(tài)學基礎。本課題采用多種分子生物學方法證實了與成牙本質(zhì)細胞極性建立密切相關(guān)的部分蛋白的表達,并對其功能進行了初步探討,以期為相關(guān)研究提供一定的基礎。
　　1.成牙本質(zhì)細胞部分極性蛋白的表達
　　提取小鼠牙髓組織和OLCs細胞的總RNA和總蛋白后,用PCR檢測cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherinmRNA的表達,用westernblot檢測cdc42蛋白的表達。OLCs細胞

4、經(jīng)固定、脫水、通透后,用細胞免疫熒光檢測cdc42在OLCs中的表達定位。出生后2周小鼠及出生前14天、16天、18天胚胎小鼠經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片后,用組織免疫熒光檢測cdc42在牙胚發(fā)育過程中的表達。結(jié)果顯示,cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherinmRNA及cdc42蛋白在牙髓組織和OLCs中皆有表達。在OLCs細胞膜和細胞漿中,cdc42皆有表達并且在細胞核周圍表達量明顯高于其他部

5、位。在牙胚發(fā)育過程中,cdc42參與了成牙本質(zhì)細胞極性化的發(fā)生過程。
　　2.成牙本質(zhì)細胞細胞連接的體外建立及其與LPS的關(guān)系
　　OLCs接種于含有α-MEM培養(yǎng)液的transwell小室中培養(yǎng)兩周后,通過掃描電鏡觀察細胞排列狀態(tài),通過透射電鏡觀察細胞間連接的建立。OLCs接種于6孔板中,各組培養(yǎng)液中加入不同濃度LPS(10ng/ml、100ng/ml、和1000ng/ml),以條件培養(yǎng)液(10ng/mlLPS)中同時加入

6、NF-κB抑制劑PDTC和LPS組作為對照;分別培養(yǎng)0.5h、1h、2h、6h,各時間點采用Westernblot觀察細胞連接蛋白E-cadherin在蛋白水平的變化;以實時定量PCR觀察細胞連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin在mRNA水平的改變。結(jié)果顯示,經(jīng)過立體培養(yǎng)的OLCs細胞間形成了明顯的細胞連接。經(jīng)過LPS處理后,ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin的m

7、RNA表達水平明顯降低,且在一定的作用時間范圍內(nèi)呈明顯的時間依賴性,但與濃度(10-1000ng/ml)無明顯依賴性。同時,E-cadherin在蛋白水平隨著LPS作用時間的延長其表達水平逐漸降低,而NF-κB抑制劑PDTC時能夠抑制這種效應。
　　3.cdc42與牙源性細胞礦化的關(guān)系
　　OLCs細胞接種培養(yǎng)至融合80％后,實驗組分別更換為礦化誘導液、含10ng/mlLPS的α-MEM培養(yǎng)液和含10ng/mlLPS礦化誘導

8、液經(jīng)一定時間培養(yǎng)后,通過westernblot測定其中cdc42含量的變化;礦化誘導液組和含ML141的礦化誘導液組培養(yǎng)一定時間后,通過茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并進行定量分析。HDPSCs在含不同濃度LPS的礦化誘導液和含不同濃度ML141的礦化誘導液中培養(yǎng)一定時間后,通過茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成并定量分析。Westernblot結(jié)果顯示,OLCs中cdc42的表達在礦化誘導液的作用下未發(fā)生明顯改變,在LPS作用下明顯上調(diào)。茜素