Nogo-B在急性肺損傷肺泡上皮細胞凋亡中的作用.pdf

1、背景:
　　急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory dirstress syndrome，ARDS）在臨床上表現為雙肺彌漫浸潤、肺順應性下降、進行性及頑固性低氧血癥，而肺部病理改變主要為血管擴張以及肺透明膜形成等。眾所周知，ARDS是臨床急危重癥，而急性肺損傷（acute lung injury）通常認為是ARDS的早期表現，或是ARDS較輕的表現形式。在2012年的ARDS柏林標準中已將ALI其歸入ARDS中。A

2、RDS的發(fā)病率約為每年86.2/100000人次，有著相當高病死率，約為38.5％。膿毒癥是與ARDS最為密切相關的危險因素中，也是ARDS最常見的病因。膿毒癥所致的ARDS與細菌細胞壁組分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)密切相關，因而很多有關ALI/ARDS的研究均使用LPS作為動物或細胞學研究制造模型的工具。迄今為止，人們已經嘗試了很多種藥物及輔助治療手段對ARDS進行治療，但其中獲得陽性結果的治療手段寥寥無幾

3、，而藥物治療更是無一能夠證實可改善該病的死亡率。這種臨床的現實迫使我們對ARDS的發(fā)病機制及發(fā)展過程進行深入研究，從中發(fā)掘出潛在的治療靶點及手段，以期將來某一天能攻克這一疾病。在病理生理學上，目前認為ARDS是機體遭受大量致病因素打擊后所產生的廣泛肺損傷。肺血管內皮-肺泡上皮屏障的受損在這種肺損傷中占據重要地位，肺血管內皮-肺泡上皮屏障受損導致其通透性增加，進而導致富含蛋白的滲出液-肺泡上皮屏障通透性增加還導致炎癥細胞如白細胞等聚集于肺

4、泡腔內加重炎癥反應，這是ARDS時的核心病理生理變化。肺泡上皮細胞是構筑該屏障的重要組分，研究發(fā)現肺泡上皮細胞的過度凋亡與ALI/ARDS的發(fā)病相關。Nogo-B又稱為網狀蛋白4B，是近年來發(fā)現的具有調控炎癥、組織修復等多種功能的一種蛋白質，定位于內質網上。進一步研究發(fā)現Nogo-B可通過參與調控內質網應激調控細胞的凋亡?，F已證實Nogo-B在多種上皮細胞中均有表達，本實驗室的前期研究也發(fā)現Nogo-B可表達于肺泡上皮細胞中。那么在LP

5、S所致的肺泡上皮損傷過程中，Nogo-B究竟扮演一個怎樣的角色，其是否并且如何參與到這個過程中目前并無相關報道。
　　方法:
　　首先我們通過LPS氣管腔內滴注的方法構建小鼠ALI模型，分別使用反轉錄和實時定量熒光PCR的方法以及蛋白免疫印跡試驗的方法觀察Nogo-B mRNA及蛋白在該模型肺組織中的表達變化情況，同時使用LPS刺激的MLE-12及A549細胞株進行細胞學研究。通過這些實驗我們的目的是明確和了解Nogo-B是

6、否有可能參與到ALI/ARDS的發(fā)病及發(fā)展過程中。
　　其次，我們分別使用Nogo-B基因敲除小鼠和野生型小鼠再次復制構建小鼠ALI模型，對兩組小鼠生存時間進行生存分析，繪制生存曲線。并對這兩種小鼠模型肺組織肺泡灌洗液總蛋白濃度以及肺組織濕/干重比這兩項炎癥指標進行檢測，同時留取小鼠肺組織做石蠟切片、HE染色進行病理學觀察，通過對比以上觀測指標，進一步了解Nogo-B基因敲除與否對小鼠ALI的病理生理學影響及其程度，確認Nogo-

7、B是否真正參與了ALI/ARDS的病理生理學過程。
　　再次，為明確Nogo-B對ALI/ARDS時肺泡上皮細胞損傷的影響是否是通過影響和調控其凋亡過程來達成的，我們使用凋亡細胞的原位末端轉移酶標記法（TUNEL）對Nogo-B基因敲除小鼠及野生型小鼠肺組織石蠟切片進行染色。通過觀察對比，了解Nogo-B基因敲除對ALI時肺內細胞凋亡的影響。此后我們再對Caspase-3活性及其活性蛋白片段表達的檢測對上述凋亡進行量化及分析。為進

8、一步明確Nogo-B對上皮細胞凋亡的影響，我們在MLE-12細胞株上進行小干擾RNA敲減及LPS刺激實驗，重復上述對Caspase-3活性及其活性蛋白片段表達量的檢測與分析。
　　最后，為明確Nogo-B是否通過調控內質網應激進而調控ALI時肺泡上皮細胞凋亡，我們在MLE-12細胞上進行了研究。通過對比小干擾RNA敲減Nogo-B表達與未敲減Nogo-B表達細胞之間Caspase-8、9的表達變化，明確Nogo-B對肺泡上皮細胞的

9、凋亡影響是在內源性細胞凋亡通路上還是在外源性細胞凋亡通路上。為明確Nogo-B是否通過調控內質網應激最終影響細胞凋亡的過程，我們選擇一種內質網應激激活劑——衣霉素對細胞進行干預，通過對比分析上述兩種不同Nogo-B表達水平細胞暴露于不同濃度衣霉素之下后再遭受LPS刺激后Caspase-3、8、9以及內質網應激標記GRP78的蛋白表達變化，最終明確Nogo-B是否通過調控內質網應激參與到ALI時肺泡上皮細胞的凋亡過程中。
　　結果:

10、
　　一、ALI動物模型和肺泡上皮細胞損傷中Nogo-B mRNA及蛋白質變化
　　實時定量熒光PCR結果顯示Nogo-B mRNA在ALI小鼠模型中表達呈下降趨勢。Nogo-B蛋白表達情況與mRNA表達情況一致，亦是在LPS氣管內滴注造模后呈下降趨勢。通過這兩項檢測，我們可以明確在小鼠ALI模型中，Nogo-B mRNA及Nogo-B蛋白的表達均發(fā)生了變化，其變化趨勢是在ALI造模后呈逐漸下降的趨勢，并且在12～48小時內

11、其下降到一個比較明顯的范圍，統(tǒng)計分析也顯示在此時間段內無論是mRNA水平還是蛋白質水平，Nogo-B的表達下降均有統(tǒng)計學意義。在上述兩種細胞中Nogo-B mRNA表達量在0-48小時的時間范圍內均呈下降趨勢，但兩種細胞株的下降的水平并不完全相同。與mRNA結果一致，在兩種細胞株接受LPS刺激后，Nogo-B蛋白表達量也呈隨時間下降的趨勢。
　　二、Nogo-B對小鼠急性肺損傷的保護作用
　　生存分析顯示，在使用致死劑量LP

12、S造模后，Nogo-B基因敲除小鼠在6小時即出現第一只死亡的小鼠，而野生型小鼠在第22小時開始出現第一只死亡小鼠。Nogo-B基因敲除小鼠絕大部分在ALI造模后的20小時內死亡，而野生型小鼠的死亡時間集中于ALI造模后20至40小時內。BALF總蛋白測定的結果顯示Nogo-B基因敲除小鼠BALF總蛋白含量明顯高于野生型小鼠，提示Nogo-B基因敲除小鼠肺血管內皮-肺泡上皮屏障破壞的程度高于野生型小鼠。同時肺組織濕/干重比測定的結果也與B

13、ALF總蛋白的變化相吻合，野生型小鼠肺濕/干重比例低于Nogo-B基因敲除小鼠。小鼠肺組織HE染色則發(fā)現Nogo-B基因敲除小鼠氣管腔內滴注LPS后肺泡間隔破壞、肺泡出血情況明顯重于野生型C57BL/6小鼠。而在使用PBS氣管腔內滴注作為對照的Nogo-B基因敲除小鼠與野生型小鼠的對比中，以上三項指標均未出現明顯的變化。
　　三、Nogo-B對急性肺損傷中肺泡上皮細胞凋亡的影響
　　使用TUNEL染色觀察到Nogo-B基因敲

14、除ALI小鼠肺組織內肺泡上皮細胞凋亡遠遠重于野生型ALI小鼠。而使用氣管腔內滴注PBS的對照組小鼠并未出現明顯的改變。ALI造模后，小鼠肺組織Caspase-3活性從呈逐漸上升的趨勢，在12至48小時的時間段內，是其增加的高峰位置。使用Western Blot方法檢測ALI造模后不同時間點小鼠肺組織內Caspase-3活性片段也顯示出類似的結果。敲減Nogo-B表達后并使用LPS刺激后24小時，MLE細胞Caspase-3活性以及Cas

15、pase-3活性片段蛋白表達均明顯高于PBS對照組。而在敲減Nogo-B表達的細胞中，LPS刺激后Caspase-3活性及Caspase-3活性片段蛋白表達量是最高的，且其與單純用LPS刺激的細胞相比其升高具有統(tǒng)計學意義。
　　四、Nogo-B調控內質網應激對肺泡上皮細胞凋亡的影響
　　使用LPS刺激細胞后24小時，MLE-12細胞株中Caspase-8活性片段表達較PBS對照組明顯升高，而使用SiRNA敲減Nogo-B基因

16、表達組其Caspase-8活性片段表達高于陰性SiRNA組。內質網應激標志GRP78在ALI小鼠肺組織中表達呈隨時間進展逐步上升的趨勢，在24-48小時的時間段內較為明顯，而在LPS刺激的MLE-12細胞株中，GRP78蛋白的變化趨勢與之類似。Nogo-B基因敲減表達+LPS刺激與單獨衣霉素刺激對凋亡及ERS的影響是一致的，兩者均使得Caspase-3活性片段和GRP78蛋白表達上升，而Caspase-9活性片段蛋白表達變化不大。而且N

17、ogo-B基因敲減表達+LPS刺激+衣霉素暴露組中，其GRP78及Caspase-3活性片段表達有高于以上兩組的趨勢。
　　結論:
　　一、LPS氣管腔內滴注所致的ALI小鼠模型肺組織中Nogo-B表達下降，LPS刺激的MLE及A549細胞中Nogo-B表達下降。因而可以Nogo-B在ALI中的表達出現了明顯的變化趨勢，提示其可能參與了ALI的病理生理過程。
　　二、敲除Nogo-B基因可使小鼠在氣管腔內滴注LPS造模

18、后生存時間縮短，并且敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺組織損傷程度加重。這進一步證實了Nogo-B在ALI的病理生理過程中發(fā)揮了一定的作用，可以明確Nogo-B的確參與了ALI的發(fā)病。
　　三、敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺泡上皮細胞凋亡增加，SiRNA敲減Nogo-B表達可使MLE-12細胞株在暴露于LPS刺激后凋亡增加。這些實驗結果則明確了敲除Nogo-B可使ALI時肺泡上皮細胞凋亡增加，反過來Nogo-B有保護ALI