Nogo-B在急性肺損傷肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、背景:
　　急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory dirstress syndrome，ARDS）在臨床上表現(xiàn)為雙肺彌漫浸潤(rùn)、肺順應(yīng)性下降、進(jìn)行性及頑固性低氧血癥，而肺部病理改變主要為血管擴(kuò)張以及肺透明膜形成等。眾所周知，ARDS是臨床急危重癥，而急性肺損傷（acute lung injury）通常認(rèn)為是ARDS的早期表現(xiàn)，或是ARDS較輕的表現(xiàn)形式。在2012年的ARDS柏林標(biāo)準(zhǔn)中已將ALI其歸入ARDS中。A

2、RDS的發(fā)病率約為每年86.2/100000人次，有著相當(dāng)高病死率，約為38.5％。膿毒癥是與ARDS最為密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素中，也是ARDS最常見的病因。膿毒癥所致的ARDS與細(xì)菌細(xì)胞壁組分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)密切相關(guān)，因而很多有關(guān)ALI/ARDS的研究均使用LPS作為動(dòng)物或細(xì)胞學(xué)研究制造模型的工具。迄今為止，人們已經(jīng)嘗試了很多種藥物及輔助治療手段對(duì)ARDS進(jìn)行治療，但其中獲得陽性結(jié)果的治療手段寥寥無幾

3、，而藥物治療更是無一能夠證實(shí)可改善該病的死亡率。這種臨床的現(xiàn)實(shí)迫使我們對(duì)ARDS的發(fā)病機(jī)制及發(fā)展過程進(jìn)行深入研究，從中發(fā)掘出潛在的治療靶點(diǎn)及手段，以期將來某一天能攻克這一疾病。在病理生理學(xué)上，目前認(rèn)為ARDS是機(jī)體遭受大量致病因素打擊后所產(chǎn)生的廣泛肺損傷。肺血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障的受損在這種肺損傷中占據(jù)重要地位，肺血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障受損導(dǎo)致其通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致富含蛋白的滲出液-肺泡上皮屏障通透性增加還導(dǎo)致炎癥細(xì)胞如白細(xì)胞等聚集于肺

4、泡腔內(nèi)加重炎癥反應(yīng)，這是ARDS時(shí)的核心病理生理變化。肺泡上皮細(xì)胞是構(gòu)筑該屏障的重要組分，研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞的過度凋亡與ALI/ARDS的發(fā)病相關(guān)。Nogo-B又稱為網(wǎng)狀蛋白4B，是近年來發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)控炎癥、組織修復(fù)等多種功能的一種蛋白質(zhì)，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Nogo-B可通過參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控細(xì)胞的凋亡?，F(xiàn)已證實(shí)Nogo-B在多種上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究也發(fā)現(xiàn)Nogo-B可表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞中。那么在LP

5、S所致的肺泡上皮損傷過程中，Nogo-B究竟扮演一個(gè)怎樣的角色，其是否并且如何參與到這個(gè)過程中目前并無相關(guān)報(bào)道。
　　方法:
　　首先我們通過LPS氣管腔內(nèi)滴注的方法構(gòu)建小鼠ALI模型，分別使用反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量熒光PCR的方法以及蛋白免疫印跡試驗(yàn)的方法觀察Nogo-B mRNA及蛋白在該模型肺組織中的表達(dá)變化情況，同時(shí)使用LPS刺激的MLE-12及A549細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究。通過這些實(shí)驗(yàn)我們的目的是明確和了解Nogo-B是

6、否有可能參與到ALI/ARDS的發(fā)病及發(fā)展過程中。
　　其次，我們分別使用Nogo-B基因敲除小鼠和野生型小鼠再次復(fù)制構(gòu)建小鼠ALI模型，對(duì)兩組小鼠生存時(shí)間進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線。并對(duì)這兩種小鼠模型肺組織肺泡灌洗液總蛋白濃度以及肺組織濕/干重比這兩項(xiàng)炎癥指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)留取小鼠肺組織做石蠟切片、HE染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，通過對(duì)比以上觀測(cè)指標(biāo)，進(jìn)一步了解Nogo-B基因敲除與否對(duì)小鼠ALI的病理生理學(xué)影響及其程度，確認(rèn)Nogo-

7、B是否真正參與了ALI/ARDS的病理生理學(xué)過程。
　　再次，為明確Nogo-B對(duì)ALI/ARDS時(shí)肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響是否是通過影響和調(diào)控其凋亡過程來達(dá)成的，我們使用凋亡細(xì)胞的原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）對(duì)Nogo-B基因敲除小鼠及野生型小鼠肺組織石蠟切片進(jìn)行染色。通過觀察對(duì)比，了解Nogo-B基因敲除對(duì)ALI時(shí)肺內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響。此后我們?cè)賹?duì)Caspase-3活性及其活性蛋白片段表達(dá)的檢測(cè)對(duì)上述凋亡進(jìn)行量化及分析。為進(jìn)

8、一步明確Nogo-B對(duì)上皮細(xì)胞凋亡的影響，我們?cè)贛LE-12細(xì)胞株上進(jìn)行小干擾RNA敲減及LPS刺激實(shí)驗(yàn)，重復(fù)上述對(duì)Caspase-3活性及其活性蛋白片段表達(dá)量的檢測(cè)與分析。
　　最后，為明確Nogo-B是否通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而調(diào)控ALI時(shí)肺泡上皮細(xì)胞凋亡，我們?cè)贛LE-12細(xì)胞上進(jìn)行了研究。通過對(duì)比小干擾RNA敲減Nogo-B表達(dá)與未敲減Nogo-B表達(dá)細(xì)胞之間Caspase-8、9的表達(dá)變化，明確Nogo-B對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的

9、凋亡影響是在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路上還是在外源性細(xì)胞凋亡通路上。為明確Nogo-B是否通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終影響細(xì)胞凋亡的過程，我們選擇一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑——衣霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，通過對(duì)比分析上述兩種不同Nogo-B表達(dá)水平細(xì)胞暴露于不同濃度衣霉素之下后再遭受LPS刺激后Caspase-3、8、9以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記GRP78的蛋白表達(dá)變化，最終明確Nogo-B是否通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與到ALI時(shí)肺泡上皮細(xì)胞的凋亡過程中。
　　結(jié)果:

10、
　　一、ALI動(dòng)物模型和肺泡上皮細(xì)胞損傷中Nogo-B mRNA及蛋白質(zhì)變化
　　實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果顯示Nogo-B mRNA在ALI小鼠模型中表達(dá)呈下降趨勢(shì)。Nogo-B蛋白表達(dá)情況與mRNA表達(dá)情況一致，亦是在LPS氣管內(nèi)滴注造模后呈下降趨勢(shì)。通過這兩項(xiàng)檢測(cè)，我們可以明確在小鼠ALI模型中，Nogo-B mRNA及Nogo-B蛋白的表達(dá)均發(fā)生了變化，其變化趨勢(shì)是在ALI造模后呈逐漸下降的趨勢(shì)，并且在12～48小時(shí)內(nèi)

11、其下降到一個(gè)比較明顯的范圍，統(tǒng)計(jì)分析也顯示在此時(shí)間段內(nèi)無論是mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平，Nogo-B的表達(dá)下降均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在上述兩種細(xì)胞中Nogo-B mRNA表達(dá)量在0-48小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)均呈下降趨勢(shì)，但兩種細(xì)胞株的下降的水平并不完全相同。與mRNA結(jié)果一致，在兩種細(xì)胞株接受LPS刺激后，Nogo-B蛋白表達(dá)量也呈隨時(shí)間下降的趨勢(shì)。
　　二、Nogo-B對(duì)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用
　　生存分析顯示，在使用致死劑量LP

12、S造模后，Nogo-B基因敲除小鼠在6小時(shí)即出現(xiàn)第一只死亡的小鼠，而野生型小鼠在第22小時(shí)開始出現(xiàn)第一只死亡小鼠。Nogo-B基因敲除小鼠絕大部分在ALI造模后的20小時(shí)內(nèi)死亡，而野生型小鼠的死亡時(shí)間集中于ALI造模后20至40小時(shí)內(nèi)。BALF總蛋白測(cè)定的結(jié)果顯示Nogo-B基因敲除小鼠BALF總蛋白含量明顯高于野生型小鼠，提示Nogo-B基因敲除小鼠肺血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障破壞的程度高于野生型小鼠。同時(shí)肺組織濕/干重比測(cè)定的結(jié)果也與B

13、ALF總蛋白的變化相吻合，野生型小鼠肺濕/干重比例低于Nogo-B基因敲除小鼠。小鼠肺組織HE染色則發(fā)現(xiàn)Nogo-B基因敲除小鼠氣管腔內(nèi)滴注LPS后肺泡間隔破壞、肺泡出血情況明顯重于野生型C57BL/6小鼠。而在使用PBS氣管腔內(nèi)滴注作為對(duì)照的Nogo-B基因敲除小鼠與野生型小鼠的對(duì)比中，以上三項(xiàng)指標(biāo)均未出現(xiàn)明顯的變化。
　　三、Nogo-B對(duì)急性肺損傷中肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響
　　使用TUNEL染色觀察到Nogo-B基因敲

14、除ALI小鼠肺組織內(nèi)肺泡上皮細(xì)胞凋亡遠(yuǎn)遠(yuǎn)重于野生型ALI小鼠。而使用氣管腔內(nèi)滴注PBS的對(duì)照組小鼠并未出現(xiàn)明顯的改變。ALI造模后，小鼠肺組織Caspase-3活性從呈逐漸上升的趨勢(shì)，在12至48小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)，是其增加的高峰位置。使用Western Blot方法檢測(cè)ALI造模后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織內(nèi)Caspase-3活性片段也顯示出類似的結(jié)果。敲減Nogo-B表達(dá)后并使用LPS刺激后24小時(shí)，MLE細(xì)胞Caspase-3活性以及Cas

15、pase-3活性片段蛋白表達(dá)均明顯高于PBS對(duì)照組。而在敲減Nogo-B表達(dá)的細(xì)胞中，LPS刺激后Caspase-3活性及Caspase-3活性片段蛋白表達(dá)量是最高的，且其與單純用LPS刺激的細(xì)胞相比其升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　四、Nogo-B調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響
　　使用LPS刺激細(xì)胞后24小時(shí)，MLE-12細(xì)胞株中Caspase-8活性片段表達(dá)較PBS對(duì)照組明顯升高，而使用SiRNA敲減Nogo-B基因

16、表達(dá)組其Caspase-8活性片段表達(dá)高于陰性SiRNA組。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志GRP78在ALI小鼠肺組織中表達(dá)呈隨時(shí)間進(jìn)展逐步上升的趨勢(shì)，在24-48小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)較為明顯，而在LPS刺激的MLE-12細(xì)胞株中，GRP78蛋白的變化趨勢(shì)與之類似。Nogo-B基因敲減表達(dá)+LPS刺激與單獨(dú)衣霉素刺激對(duì)凋亡及ERS的影響是一致的，兩者均使得Caspase-3活性片段和GRP78蛋白表達(dá)上升，而Caspase-9活性片段蛋白表達(dá)變化不大。而且N

17、ogo-B基因敲減表達(dá)+LPS刺激+衣霉素暴露組中，其GRP78及Caspase-3活性片段表達(dá)有高于以上兩組的趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　一、LPS氣管腔內(nèi)滴注所致的ALI小鼠模型肺組織中Nogo-B表達(dá)下降，LPS刺激的MLE及A549細(xì)胞中Nogo-B表達(dá)下降。因而可以Nogo-B在ALI中的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的變化趨勢(shì)，提示其可能參與了ALI的病理生理過程。
　　二、敲除Nogo-B基因可使小鼠在氣管腔內(nèi)滴注LPS造模

18、后生存時(shí)間縮短，并且敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺組織損傷程度加重。這進(jìn)一步證實(shí)了Nogo-B在ALI的病理生理過程中發(fā)揮了一定的作用，可以明確Nogo-B的確參與了ALI的發(fā)病。
　　三、敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，SiRNA敲減Nogo-B表達(dá)可使MLE-12細(xì)胞株在暴露于LPS刺激后凋亡增加。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果則明確了敲除Nogo-B可使ALI時(shí)肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，反過來Nogo-B有保護(hù)ALI