T型電壓依賴性鈣通道在慢性心房顫動的犬及人的肺靜脈前庭組織中的表達(dá)改變.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、心房顫動(Atrial fibrillation,AF)是臨床上最為常見的心律失常,其主要表現(xiàn)為≥400次/分鐘的不規(guī)則節(jié)律的沖動引起心房各部分的快速顫動,它對人類健康的影響不容小覷。不論導(dǎo)致何種并發(fā)癥,AF均可顯著增加患者的致殘率和死亡率。它常伴有左心室收縮功能減退和充血性心力衰竭,還可以引起腦血管栓塞。AF可以惡化患者的生活質(zhì)量,并消耗大量的醫(yī)療資源。但由于目前對于AF的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚,因此目前臨床上對AF的治療尚缺乏有效手段

2、。對于房顫目前存在多種假說,研究熱點主要集中于“肺靜脈起源學(xué)說”。
   肺靜脈前庭(Pulmonary Vein Antrum,PVA)是肺靜脈和左房相延續(xù)的區(qū)域,胚胎發(fā)育中由肺靜脈與左房融合、吸收逐漸形成,該處肌纖維走行復(fù)雜,可呈環(huán)形、縱行或斜行排列,不同肌纖維相互交錯、各向異性明顯,激動在此處傳導(dǎo)時存在明顯延緩或阻滯。肺靜脈及其前庭組織與心房顫動的發(fā)生、維持密切相關(guān),深入認(rèn)識肺靜脈前庭區(qū)域的組織解剖學(xué)特點,對理解心房顫動發(fā)

3、生、維持機(jī)制,進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療具有重要意義
   肺靜脈之所以被認(rèn)為是與房顫發(fā)生和維持機(jī)制關(guān)系最為密切的腔靜脈,是與其特有的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)分不開的。研究發(fā)現(xiàn),在肺靜脈.左房交接部位,即PVA區(qū)域,有心房肌纖維延伸進(jìn)入肺靜脈內(nèi),稱為心肌袖細(xì)胞,其中部分心肌袖細(xì)胞具有自律性,而且不應(yīng)期較短。同時,PVA的心肌纖維排列具有高度的非均一性,是心房內(nèi)各向異性傳導(dǎo)最為顯著的部位,不但容易形成致心律失常局灶,而且容易形成肺靜脈-左房折返,當(dāng)快速激

4、動通過這一部位時易導(dǎo)致顫動樣傳導(dǎo)。來自臨床的資料也顯示,通過導(dǎo)管消融阻斷肺靜脈與左房之間的電傳導(dǎo),可以使絕大多數(shù)的陣發(fā)房顫和部分慢性房顫得到根治。
   Perez-Lugones等于2003年首次在人類肺靜脈內(nèi)發(fā)現(xiàn)起搏細(xì)胞(P細(xì)胞)和移行細(xì)胞。這提示肺靜脈可能具有潛在起搏活性。對于P細(xì)胞而言,0期緩慢去極化是其起搏功能的基礎(chǔ),現(xiàn)有研究已經(jīng)證明,慢反應(yīng)自律細(xì)胞的0期緩慢去極化是由電壓依賴性T型鈣離子通道(Voltage Depe

5、ndant T-Type Calcium Channel,VDTTCC)在靜息狀態(tài)下緩慢激活所產(chǎn)生,因此,P細(xì)胞的起搏活性與電壓依賴性T型鈣離子通道的分布及功能密切相關(guān)。同時,T型鈣離子通道還參與了P細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié),而心肌細(xì)胞內(nèi)的“鈣超載”擬被證明是繼發(fā)性心房顫動得以產(chǎn)生和維持的重要環(huán)節(jié)。因此,明確房顫時VDTTCC在肺靜脈前庭組織中的表達(dá)和分布對于闡明房顫發(fā)生的機(jī)制很有意義,同時能夠?qū)﹂_辟新的臨床療法提供基礎(chǔ)證據(jù)。

6、>   本研究著眼于VDTTCC在房顫是PVA區(qū)域的表達(dá)水平的改變,首先利用快速心房起搏(Rapid Atrial Pacing,RAP)的方法建立慢性心房顫動的動物模型,利用動物模型所獲得的PVA標(biāo)本,在分子生物學(xué)及病理形態(tài)學(xué)兩方面研究VDTTCC的表達(dá)改變,并在動物實驗結(jié)論的基礎(chǔ)上,謹(jǐn)慎的開展臨床觀察實驗,通過臨床獲得的PVA標(biāo)本,對我們的假設(shè)及動物實驗的結(jié)論進(jìn)行驗證。
   初步的研究發(fā)現(xiàn),VDTTCC在房顫動物及患者的

7、PVA的表達(dá)(mRNA轉(zhuǎn)錄及通道蛋白表達(dá)水平)均較竇性心律對照組顯著上調(diào)。
   第一部分經(jīng)右心房快速起搏法建立犬的慢性房顫模型
   目的:利用右心房快速起搏的方法建立犬的慢性持續(xù)性房顫模型。
   方法:將實驗動物(Beagle犬)共計12只,隨機(jī)分為實驗組及對照組,實驗組動物經(jīng)開胸手術(shù)于右心房放置高頻電刺激期,頻率400-450次/分,對照組動物開胸后于右心房相同部位縫合一針縫線后關(guān)胸。實驗組持續(xù)快速起搏8

8、周,每周記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖,術(shù)前及8周后采集心超數(shù)據(jù),計算左右心房長軸面積。
   結(jié)果:所有實驗組及對照組12只動物均存活。經(jīng)過8周心房快速起搏后,所有實驗組動物均能誘發(fā)出房顫,其中3只動物無須誘發(fā)即可維持房顫狀態(tài),另3只動物經(jīng)誘發(fā)獲得的房顫持續(xù)時間52±15min,均符合慢性房顫要求。實驗組動物快速起搏后的左右心房面積均顯著大于起搏前,而對照組動物則無變化。
   結(jié)論:利用右心房快速起搏的方法可成功建立可自我維持的

9、慢性心房顫動的動物模型。長期的快速心房起搏可明顯增加左右心房的面積。
   第二部分心房顫動時犬的肺靜脈前庭組織中T型鈣離子通道的表達(dá)改變
   目的:通過人工建立的慢性心房顫動模型獲得肺靜脈前庭組織,并利用半定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法研究電壓依賴性T型鈣離子通道在PVA區(qū)域的表達(dá)和分布。
   方法:安樂死處死實驗動物,獲取PVA區(qū)域組織,洗凈血液后分為兩部分,分別保存于-80℃冰箱及福爾馬林溶液

10、中。針對犬的T型鈣離子通道α1H亞基cDNA序列設(shè)計引物,用半定量PCR法測定兩組PVA組織中該亞基的轉(zhuǎn)錄水平,并進(jìn)行半定量分析。采用免疫印跡法(Western-Blot)測定該亞基蛋白在組織中的含量,并進(jìn)行半定量分析。對PVA組織進(jìn)行H-E染色及免疫組織化學(xué)染色,并觀察比較形態(tài)學(xué)差異。
   結(jié)果:實驗組犬的肺靜脈前庭組織中TTCC的α1H亞基的mRNA表達(dá)豐度及亞基蛋白的表達(dá)水平均較對照組明顯升高,H-E染色及免疫組織化學(xué)染

11、色結(jié)果與前一結(jié)論符合,并證實α1H亞基蛋白定位于心肌細(xì)胞膜表面。
   結(jié)論:實驗組動物的PVA組織中TTCC的表達(dá)較對照組顯著上調(diào)。
   第三部分心房顫動時人的肺靜脈前庭組織中T型鈣離子通道的表達(dá)改變
   目的:術(shù)中采集慢性心房顫動患者及竇性心律患者的肺靜脈前庭組織,并利用實時熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法研究電壓依賴性T型鈣離子通道在PVA區(qū)域的表達(dá)和分布。
   方法:所有納入患者

12、在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前,于右上肺靜脈放置左房吸引管處預(yù)置荷包線并套管,以主動脈打孔器在荷包中心切取少量肺靜脈前庭組織(約200mg~400mg),于冰生理鹽水中洗凈血跡,分為兩部分,一部分剪切為小塊組織后放入無RNA酶的凍存管中,迅速置入液氮中冷凍,隨后轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱保存;剩下組織放入10%中性福爾馬林溶液中固定,留作免疫組化染色用。針對人的T型鈣離子通道α1G及α1H亞基cDNA序列設(shè)計引物,用實時熒光定量PCR法

13、測定兩組PVA組織中兩種亞基的轉(zhuǎn)錄水平,并進(jìn)行相對定量分析(2-△△Ct法)。采用免疫印跡法(Western-Blot)測定該亞基蛋白在組織中的含量,并進(jìn)行半定量分析。對PVA組織進(jìn)行H-E染色及免疫組織化學(xué)染色,并觀察比較形態(tài)學(xué)差異。
   結(jié)果:AF組患者的PVA組織中FTCC的α1H亞基的mRNA表達(dá)豐度及亞基蛋白的表達(dá)水平均較SR組明顯升高,但α1G亞基在兩組中的表達(dá)水平接近,H-E染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與前一結(jié)論符

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