產(chǎn)彈性蛋白酶芽孢桿菌的選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、彈性蛋白酶(Elastase)是一種以水解不溶性彈性蛋白為特征的蛋白水解酶。目前彈性蛋白酶主要從動物胰臟中提取，但受動物臟器資源的限制，該酶在醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)供不應(yīng)求。應(yīng)用微生物方法篩選高產(chǎn)彈性蛋白酶菌株成為解決該酶供需矛盾的途徑之一。本研究從菌種的篩選入手，通過誘變提高菌株產(chǎn)彈性蛋白酶活力，優(yōu)化其發(fā)酵條件，并對該酶的酶解特性進行了初步研究。 (1)從屠宰場，牛奶場和啤酒廠等附近采集的土樣和污水中，通過彈性

2、蛋白初篩平板篩選獲得209株產(chǎn)彈性蛋白酶的菌株，對彈性蛋白水解圈和菌落直徑之比(HC)比值較大的73株菌進行搖瓶復(fù)篩，得到一株酶活力最高的菌株SCEL01，酶活為33U/mL。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA分子遺傳學(xué)分析(該菌株的16S rDNA序列在Genbank的登錄號為EFl03289)，該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。該菌株經(jīng)過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)多輪誘變后，篩選得到一

3、株產(chǎn)彈性蛋白酶活力較高且產(chǎn)酶穩(wěn)定的菌株BEN01，酶活較出發(fā)菌株提高了36％，達到45U/mL。 (2)確定了菌株BEM01的最佳碳源和氮源，分別是葡萄糖和干酪素。吐溫-80作為生長因子能刺激菌株產(chǎn)酶和生長。采用三因素三水平L<,9>(3<'3>)正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、干酪素和吐溫-+80進行了優(yōu)化，極差分析表明影響該菌株產(chǎn)彈性蛋白酶的主次關(guān)系為：葡萄糖>干酪素>吐溫-80。該菌株產(chǎn)彈性蛋白酶培養(yǎng)基最佳組合為：葡萄糖2％

4、，干酪素2％，吐溫0.01％，K<,2>HPO<,4> 0.2％，MgSO<,4> 0.01％。以最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明，發(fā)酵液初始pH為7.5，培養(yǎng)溫度為37℃、裝液20mL/300mL三角瓶、種子液接種齡24h，按發(fā)酵液的3％接種種子液，發(fā)酵36h，菌株產(chǎn)彈性蛋白酶達到最高水平，為59U/mL，較優(yōu)化前酶活提高了31％。 (3)相同活力的胰彈性蛋白酶、枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶對彈性蛋白、干酪素、明膠和牛血清