中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及發(fā)酵條件研究.pdf

1、中性蛋白酶是人類最早發(fā)現(xiàn)的蛋白酶制劑之一，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、洗滌業(yè)、皮革業(yè)以及醫(yī)學(xué)治療等領(lǐng)域中。目前市場應(yīng)用的蛋白酶來源中以細菌蛋白酶最多,選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株仍是當前的研究重點。提高微生物產(chǎn)中性蛋白酶途徑有很多，簡單有效的誘變方法仍是研究的課題。 從土壤中分離的產(chǎn)中性蛋白酶菌株N19，經(jīng)初步鑒定為枯草芽孢桿菌。以N19為出發(fā)菌株，考察了紫外線、微波以及亞硝酸等傳統(tǒng)誘變方法對該菌的誘變效果。最終篩選到了一株產(chǎn)酶量比出發(fā)菌株提

2、高408％的突變株UMN-26，菌株蛋白酶酶活由158U/mL提高到803U/mL。傳代十次，具有很好的遺傳穩(wěn)定性?？梢姡梦锢砗突瘜W(xué)復(fù)合誘變的方法是提高微生物產(chǎn)中性蛋白酶活力的有效途徑。 在搖瓶發(fā)酵水平上，對UMN-26菌的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行了研究，確定了其最佳培養(yǎng)基成分及最佳培養(yǎng)條件。研究了不同碳源、氮源、無機鹽、吐溫-80等因素對UMN-26菌產(chǎn)酶的影響，發(fā)現(xiàn)酵母膏、蔗糖、玉米漿濃度對產(chǎn)酶的影響較大。對酵母膏、蔗糖、玉米漿

3、各選取三個水平進行正交試驗，確定UMN-26菌產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基成分為酵母膏2％、蔗糖1.5％、玉米漿1.5％。通過搖瓶發(fā)酵試驗，確定其最佳培養(yǎng)條件為:搖床37℃，240rpm，發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH為6.5，接種量為2.5％(V/V)裝液量為40mL/300mL，培養(yǎng)32h。在此條件下培養(yǎng)，酶活力達1378U/mL，是優(yōu)化前的1.72倍。 對比誘變前后的菌株產(chǎn)酶發(fā)酵曲線，出發(fā)菌株和突變株的生物量及pH值曲線無明顯變化，產(chǎn)酶曲線仍是

4、兩個峰，突變菌株酶活從出現(xiàn)第二個高峰后下降不多，維持相對較高水平，更適于應(yīng)用于生產(chǎn)。 研究了菌株UMN-26發(fā)酵粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明該酶的最適催化溫度為65℃；其熱穩(wěn)定性為65℃水浴保溫30min，酶活保持50％，且隨著溫度的升高酶活下降很快。該蛋白酶在pH6～8作用酶活較高，酶的最適pH值為7.0，屬中性蛋白酶。在不同pH下的穩(wěn)定性試驗顯示，該酶在pH6.5～8.0內(nèi)表現(xiàn)出高的，比較穩(wěn)定的蛋白酶活性，在pH7最穩(wěn)定。該蛋