短期高鹽攝入誘導(dǎo)的Th17-Treg細(xì)胞免疫失衡與靶器官炎癥反應(yīng)的關(guān)系.pdf

1、研究目的:高鹽(high salt，HS)飲食不僅是高血壓的致病因素，還能獨(dú)立于血壓水平造成靶器官損傷。越來(lái)越多的證據(jù)顯示免疫系統(tǒng)在高血壓及其靶器官損傷發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中機(jī)體獲得性免疫機(jī)制是引發(fā)靶器官炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。近來(lái)研究顯示，輔助性T細(xì)胞17(T helper cell17，Th17)（生成白介素-17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryT cell，Treg)(表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3)各自發(fā)揮促炎和抗炎效應(yīng)。Th1

2、7/Treg免疫平衡的調(diào)控是目前研究的熱點(diǎn)。由Th17/Treg免疫失衡所致炎癥紊亂，即免疫-炎癥軸失衡參與了靶器官炎癥反應(yīng)和損傷。高鹽攝入是否可通過(guò)影響人類(lèi)Th17/Treg平衡進(jìn)而引起靶器官的炎癥反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在對(duì)健康志愿者中通過(guò)慢性鹽負(fù)荷試驗(yàn)，觀察在此期間外周血Th17/Treg免疫平衡的動(dòng)態(tài)變化，并探討其可能機(jī)制，以及與靶器官炎癥反應(yīng)的關(guān)系。
　　研究?jī)?nèi)容與方法:共納入健康男性志愿者15人。平均26.93±0.9

3、2歲。
　　(1)按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）每日低于5g食鹽（即NaCl）的攝入量作為低鹽飲食標(biāo)準(zhǔn)。高鹽飲食的標(biāo)準(zhǔn)確定為15g/日。由研究者按以上食鹽攝入標(biāo)準(zhǔn)，給所有志愿者統(tǒng)一提供飲食并在同一地點(diǎn)就餐。整個(gè)飲食干預(yù)時(shí)間共17天，分為基線期（第1-3天，志愿者依據(jù)個(gè)人口味在同一地點(diǎn)自由進(jìn)餐，共3天），隨后緊接高鹽期（第4-10天，共7天），最后進(jìn)入低鹽期（第11-17天，共7天）。

4、
　　(2)每天測(cè)量并記錄收縮壓、舒張壓和心率。于基線期第3天(day3，D3)，高鹽第7天(day10，D10)，低鹽期第7天(day17，D17)收集24小時(shí)尿，進(jìn)行常規(guī)生化等檢驗(yàn)。
　　分別在基線第3天(day3，D3)，高鹽飲食第1天(day4，D4)、高鹽飲食第2天(day5，D5)、高鹽飲食第7天(day10，D10)、低鹽飲食第7天(day17，D17)采集受試者外周血進(jìn)行免疫細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)（flow cyto

5、metry，F(xiàn)CM）檢測(cè)，對(duì)CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞(CD19)，以及Th17和Treg細(xì)胞表面分子抗體（CD4、CD25、IL-17和FoxP3）進(jìn)行四色流式分析。對(duì)基線第3天(day3，D3)和高鹽第2天(day4，D4)采集外周血使用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)譜分析。使用TRIzol試劑裂解單個(gè)核細(xì)胞后，提取總RNA;采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)表達(dá)譜分析確定的感興趣差異基因進(jìn)行

6、mRNA水平的驗(yàn)證。
　　分別于基線第3天(day3，D3)，高鹽飲食第1天(day4，D4)、高鹽飲食第7天(day10，D10)、低鹽飲食第1天(day11，D11)，低鹽飲食第7天(day17，D17)采用飛利浦Intera3.0T全身磁共振系統(tǒng)對(duì)受試者腹部橫斷面T2WI掃描及冠狀面高清BOLD-MRI掃描并計(jì)算腎髓質(zhì)的表觀-自旋弛豫率（R2*，R2*值與局部組織氧合水平呈正相關(guān)）。
　　分別于基線第3天(day3，D

7、3)，高鹽飲食第1天(day4，D4)、高鹽飲食第7天(day10，D10)、低鹽飲食第7天(day17，D17)通過(guò)無(wú)創(chuàng)超聲評(píng)價(jià)肱動(dòng)脈血流介導(dǎo)性的血管舒張(flow mediated dilation，F(xiàn)MD)。
　　結(jié)果:15名志愿者完成全部飲食干預(yù)及血液和尿液的有關(guān)檢測(cè)，并根據(jù)24小時(shí)尿量、尿鈉總量、尿肌酐總量以及血鈉水平等指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制并判定所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。
　　(1)尿量、尿電解質(zhì)和尿肌酐的變化:與基線期相比，

8、高鹽飲食期第7天24小時(shí)尿量（2241±615mL vs.1773±918mL）、尿鈉（325.6±43.3mmolvs.152.9±52.1 mmol）、尿鉀（38.9±8.9mmol vs.30.2±9.7mmol）均明顯升高，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05）。與高鹽飲食期第7天相比，低鹽飲食期第7天尿量、尿Na+、尿K+顯著降低且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.001)。高鹽飲食期與基線期和低鹽飲食期相比24小時(shí)尿肌酐顯著升高（P均＜

9、0.001）。
　　(2)血壓、心率的變化:與基線期相比，高鹽期收縮壓和舒張壓有上升趨勢(shì)，低鹽期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而心率在高鹽飲食期明顯增快(P＜0.01)，心率在低鹽期較高鹽期減慢(P＜0.05)。
　　(3)流式分析結(jié)果:CD3+、CD4+T細(xì)胞亞群及B淋巴細(xì)胞(CD19)均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。食鹽攝入變化可導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞比例發(fā)生變化，高鹽第2天Th17細(xì)胞數(shù)量較基線水

10、平下降(P＜0.05)，而Treg細(xì)胞數(shù)量較基線水平升高(P＜0.05)。而隨著高鹽攝入的持續(xù)，Th17細(xì)胞數(shù)量增加，而Treg細(xì)胞數(shù)量降低，至高鹽第7天Th17/Treg比例較基線與低鹽第7天均明顯升高（P＜0.05）。
　　(4)基因芯片表達(dá)譜分析結(jié)果顯示:與基線相比，高鹽飲食第2天Th17相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)，而Treg相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。相關(guān)基因SGK-1表達(dá)上調(diào)。
　　(5)表達(dá)譜

11、芯片的PCR驗(yàn)證，即炎癥因子IL-23和IL-8第一天時(shí)表達(dá)下降(P＜0.05)，Th17通路因子CD247表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，隨后相關(guān)炎癥因子如NFκB隨高鹽負(fù)荷加重表達(dá)逐漸升高(P＜0.05)。NFAT5在高鹽第2天表達(dá)升高(P＜0.05)，SGK-1也表達(dá)升高(P＜0.05)。隨著高鹽負(fù)荷加重，炎癥因子表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而Treg相關(guān)抑制因子表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　(6)腎髓質(zhì)氧合水平的變化:腎髓質(zhì)R2

12、*值在高鹽期同基線期比顯著升高(P＜0.05)，且維持于相對(duì)穩(wěn)定水平;增加的腎髓質(zhì)R2*值在低鹽期逐漸下降至基線水平，低鹽第7天腎髓質(zhì)R2*值同高鹽期比顯著下降(P＜0.05)。
　　(7)FMD結(jié)果表明:高鹽飲食第1天FMD較基線期及高鹽飲食第7天明顯升高(P＜0.05)，至低鹽期恢復(fù)至基線期水平，無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:本研究首次證實(shí)高鹽飲食能夠引起健康志愿者循環(huán)中Th17/Treg免疫細(xì)胞比例和相關(guān)基因