維甲酸調(diào)控Th17-Treg免疫失衡在牙周炎中的作用研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　采用高菌量牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)感染小鼠口腔的方法建立牙周炎動(dòng)物模型，明確牙周炎發(fā)病過(guò)程中輔助性T(Thelper，Th)17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T(regulatoryT，Treg)細(xì)胞的免疫狀態(tài);通過(guò)體內(nèi)對(duì)P.gingivalis誘導(dǎo)的牙周炎小鼠進(jìn)行全反式維甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)干預(yù)和體外采用維甲酸受體(retino

2、idacidreceptor，RAR)α拮抗劑LE135阻斷的實(shí)驗(yàn)體系，明確ATRA對(duì)牙周炎的作用，分析ATRA對(duì)牙周炎中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響并進(jìn)一步探討相關(guān)的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1、Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在牙周炎小鼠中的免疫狀態(tài)分析
　　選用7周齡C57BL/6雌性小鼠，以1×109P.gingivalisW83連續(xù)7天感染小鼠口腔，建立牙周炎動(dòng)物模型。于感染后的第4周取材，通過(guò)測(cè)量

3、從釉牙骨質(zhì)界(cemento-enameljunction，CEJ)到牙槽嵴頂?shù)木嚯x(alveolarbonecrest，ABC)評(píng)價(jià)牙槽骨吸收情況;采用蘇木素-伊紅(Hematoxylinandeosin，HE)染色的方法觀察牙周組織中炎細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)締組織附著喪失和牙槽骨吸收情況;應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)檢測(cè)頸部淋巴結(jié)、外周血和脾臟中CD4+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞比例、CD4+維甲酸相關(guān)核孤兒受體(retinoid-relatedor

4、phanreceptor，ROR)γτ+(RORγτ為Th17細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子）、CD4+叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄分子(forkheadboxP3，F(xiàn)oxp3)+(Foxp3為Treg細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子)和核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand，RANKL)+CD4+細(xì)胞在總的CD4+T細(xì)胞中的細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)量;應(yīng)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetrans

5、cription-polymerasechainreaction，RT-PCR)方法檢測(cè)牙齦組織和頸部淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞相關(guān)因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β1mRNA的表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)牙齦組織、頸部淋巴結(jié)、血清和脾

6、臟中IL-17A、IL-10和TGF-β1的蛋白表達(dá)情況。
　　2、ATRA對(duì)牙周炎小鼠Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響及相關(guān)機(jī)制研究
　　選用7周齡C57BL/6雌性小鼠，以P.gingivalis誘導(dǎo)建立的牙周炎小鼠為研究對(duì)象，體內(nèi)隔日灌胃ATRA(25μg/g體重)和體外給予不同實(shí)驗(yàn)組ATRA(2×10-5mol/L)及ATRA(2×10-5mol/L)+維甲酸受體(retinoidacidreceptor，R

7、AR)α阻斷劑LE135(2×10-5mol/L)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠的體重，觀察P.gingivalis感染后小鼠的體重變化;測(cè)量從CEJ到ABC的距離評(píng)價(jià)牙槽骨的吸收情況;HE染色法觀察牙周組織中炎細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)締組織附著喪失和牙槽骨吸收情況;應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)檢測(cè)頸部淋巴結(jié)、外周血、脾臟以及體外培養(yǎng)細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞比例、CD4+RORγτ+(Th17)、CD4+Foxp3+(Treg)和RANKL+

8、CD4+細(xì)胞在總的CD4+T細(xì)胞中的細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)量;應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)牙齦組織和頸部淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1mRNA的表達(dá);ELISA方法檢測(cè)牙齦組織、頸部淋巴結(jié)、血清、脾臟和體外培養(yǎng)細(xì)胞上清中IL-17A、IL-10和TGF-β1的蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphen-yl

9、tetrazoliumbromide，MTT)法檢測(cè)頸部淋巴結(jié)和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況。此外，為了排除ATRA對(duì)P.gingivalisW83的直接作用，以不同濃度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)的ATRA處理P.gingivalisW83，通過(guò)比色法分析P.gingivalisW83生長(zhǎng)率;以不同濃度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)ATRA處理的P.g

10、ingivalisW83與1％羊紅細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察紅細(xì)胞的凝集情況;以不同菌量(3×109、2×109、1×109)ATRA(2×10-5mol/L)處理的P.gingivalisW83皮下注射，觀察小鼠的生存情況和測(cè)量注射區(qū)皮損大小。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、在牙周炎中存在Th17/Treg免疫失衡
　　(1)與P.gingivalis感染對(duì)照組小鼠相比，牙周炎小鼠的Th17細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)量顯

11、著增加，而Treg細(xì)胞的細(xì)胞比例明顯降低，Treg細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量變化不顯著;
　　(2)與P.gingivalis感染對(duì)照組小鼠相比，雖然牙周炎小鼠Th17細(xì)胞相關(guān)促炎性細(xì)胞因子IL-17A以及Treg細(xì)胞相關(guān)抑炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1表達(dá)增高，但I(xiàn)L-10和TGF-β1不能有效對(duì)抗增高的IL-17A，不能抑制牙周炎。
　　此外，與P.gingivalis感染對(duì)照組小鼠相比，牙周炎小鼠的牙齦組織、頸部淋巴結(jié)和外周

12、血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化較脾臟明顯。
　　2、ATRA通過(guò)調(diào)控Th17/Treg免疫失衡抑制牙周炎
　　(1)ATRA抑制P.gingivalis誘導(dǎo)的小鼠牙周炎:ATRA有效抑制P.gingivalis誘導(dǎo)的牙槽骨吸收，減輕牙周組織的炎癥程度和結(jié)締組織附著喪失。
　　(2)ATRA顯著下調(diào)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，上調(diào)Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，ATRA有效降低CD4+ROR

13、γτ+(Th17)細(xì)胞的細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)量并下調(diào)其相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子IL-17A的表達(dá)，降低RANKL+CD4+細(xì)胞的細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)增加CD4+Foxp3+(Treg)細(xì)胞的細(xì)胞比例并上調(diào)其相關(guān)的抑炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1的表達(dá)。體外研究發(fā)現(xiàn)，ATRA對(duì)Th17/Treg免疫失調(diào)的調(diào)控作用以及對(duì)RANKL+CD4+細(xì)胞的抑制作用可被RARα拮抗劑LE135阻斷。而且，我們從P.gingivalisW83的生長(zhǎng)率、

14、凝集能力和毒力三個(gè)方面分析了ATRA對(duì)P.gingivalisW83的直接影響。研究發(fā)現(xiàn)，雖然ATRA能降低P.gingivalisW83的生長(zhǎng)率，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在凝集功能方面，不同濃度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)的ATRA對(duì)P.gingivalisW83凝集羊紅細(xì)胞的功能無(wú)明顯影響;在相同菌量注射后，ATRA對(duì)小鼠的生存率無(wú)明顯影響，并且雖然在注射后的第2天和第6天ATRA組小鼠的皮

15、損小于DMSO對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　此外，ATRA組小鼠牙齦組織、頸部淋巴結(jié)和外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子受ATRA的影響較脾臟更為顯著。
　　結(jié)論
　　1、在牙周炎小鼠中存在Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)，表現(xiàn)為Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，而Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答減弱。
　　2、牙齦組織、頸部淋巴結(jié)和外周血可能是宿主對(duì)抗牙周致病菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞來(lái)源。