Notch信號(hào)在免疫性血小板減少癥患者Th17-Treg失衡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 免疫性血小板減少癥（Immunethrombocytopenia,ITP）是一種免疫介導(dǎo)的血小板破壞過多和生成減少而引起的自身免疫性疾病。盡管B細(xì)胞介導(dǎo)的抗血小板自身抗體的產(chǎn)生在其中發(fā)揮重要作用，但I(xiàn)TP的精確發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前普遍認(rèn)為，T細(xì)胞免疫功能紊亂促進(jìn)了ITP的發(fā)展，其中輔助性T細(xì)胞(Th)及其細(xì)胞因子在ITP的發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。Th17及Treg細(xì)胞是近年來較新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞

2、亞群，其分化與功能不同于Th1細(xì)胞及Th2細(xì)胞。Th17/Treg平衡控制著自身免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能上起關(guān)鍵作用，其失衡會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病。目前研究顯示，Th17/Treg失衡可能促進(jìn)ITP的發(fā)展。Notch信號(hào)在各種細(xì)胞功能上起關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等。然而，Notch信號(hào)在ITP患者Th17/Treg失衡中的確切機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　 研究目的:
　　 本研究旨在進(jìn)一步驗(yàn)證ITP患者中存在Th17

3、/Treg失衡，探討Notch信號(hào)在ITP患者Th17/Treg失衡中的作用及機(jī)制，進(jìn)一步闡明ITP的發(fā)病機(jī)制，并可能為ITP的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 研究方法:
　　 選取2011年3月至2012年5月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收治的新診斷的ITP患者及健康志愿者為研究對(duì)象，收集外周靜脈血。采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別用不同濃度的γ-分泌酶抑制劑DAPT處理，對(duì)照組用等體積的DMSO處理，在I

4、L-2維持下，在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)72h。收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及Th17/Treg比值在各組中的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測Notch信號(hào)分子(Notch1、Hes1和Hey1)及Th17和Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（RORγt和Foxp3）的mRNA表達(dá)情況，用CCK-8和凋亡試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖和凋亡的變化;收集上清，采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測IL-17、IL-21及IL

5、-10在各組中的水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.DAPT抑制Notch信號(hào):經(jīng)過不同濃度DAPT處理之后，Notch1在ITP患者及正常健康人中的表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。與DMSO組相比，Hes1和Hey1在ITP患者各實(shí)驗(yàn)組中的mRNA表達(dá)水平降低，且在5μmol/LDAPT、10岬ol/LDAPT和20μmol/LDAPT組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。與DMSO組相比，Hes1和H

6、ey1在正常健康人各實(shí)驗(yàn)組中的mRNA表達(dá)水平降低，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 2.DAPT抑制Notch信號(hào)下調(diào)ITP患者升高的Th17細(xì)胞及Th17/Treg比值。
　　 2.1.與正常健康人相比，Th17細(xì)胞在ITP患者中的水平明顯升高，Treg細(xì)胞的表達(dá)水平顯著降低，Th17/Treg的比值顯著升高(p＜0.05)。
　　 2.2.與DMSO組相比，ITP患者各實(shí)驗(yàn)組中Th17細(xì)胞及Th1

7、7/Treg比值明顯下降，而且這種下降具有劑量依賴性，在20μmol/LDAPT作用下降到最低(p＜0.05);ITP患者各實(shí)驗(yàn)組中Treg細(xì)胞有輕微升高趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 3.DAPT抑制Notch信號(hào)對(duì)ITP患者Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響:與DMSO組相比，ITP患者各實(shí)驗(yàn)組中IL-17的水平明顯降低，而且這種下降具有劑量依賴性，在20μmol/LDAPT作用下降到最低(p＜0.0

8、5)。與DMSO組相比，IL-21和IL-10在ITP患者實(shí)驗(yàn)組中的水平未見明顯變化(p＞0.05)。
　　 4.DAPT抑制Notch信號(hào)后RORγt和Foxp3mRNA表達(dá)的檢測:
　　 4.1.與正常健康人相比，RORγt在ITP患者中的mRNA表達(dá)水平明顯升高，F(xiàn)oxp3在ITP患者中的mRNA表達(dá)水平顯著降低，RORγt/Foxp3比值在ITP患者中顯著升高(p＜0.05)。
　　 4.2.與DMSO組

9、相比，RORγt在ITP患者各實(shí)驗(yàn)組中的mRNA表達(dá)水平明顯降低(p＜0.05)，而且這種下降具有劑量依賴性，在20μmol/LDAPT組中下降到最低(p＜0.05)。Foxp3在ITP患者各實(shí)驗(yàn)組中的mRNA表達(dá)雖有升高趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。RORγt/Foxp3比值在ITP患者各實(shí)驗(yàn)組中的水平雖表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 5.DAPT抑制Notch信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡:在IT

10、P患者中，與DMSO組相比，10μmol/LDAPT組與20μmol/LDAPT組中細(xì)胞凋亡率明顯升高(p＜0.05);在正常健康人中，20μmol/LDAPT組中細(xì)胞凋亡率明顯高于DMSO組(p＜0.05)，20μmol/LDAPT組細(xì)胞凋亡率明顯高于2.5μmol/LDAPT組和5μmol/LDAPT組(p＜0.05)。
　　 6.DAPT抑制Notch信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖的影響:在ITP患者中，與DMSO組相比，各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞增

11、殖未見明顯變化(p＞0.05)。在正常健康人中，DAPT對(duì)細(xì)胞增殖也無明顯影響(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在ITP患者中存在Th17及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt升高、Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3降低、以及Th17/Treg和RORγt/Foxp3比值的升高，推測Th17/Treg失衡在ITP的發(fā)病中具有重要的作用;
　　 2.抑制Notch信號(hào)通路，可顯著降低ITP患者中Th17細(xì)胞、輕微升高Tr

12、eg細(xì)胞、糾正Th17/Treg比值失衡;
　　 3.抑制Notch信號(hào)通路，可降低ITP患者中Th17細(xì)胞因子IL-17及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt，Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-10及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3變化未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　 4.抑制Notch信號(hào)通路，能夠誘導(dǎo)ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡;
　　 5.DAPT阻斷Notch信號(hào)活性，通過下調(diào)RORγt轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)來逆轉(zhuǎn)ITP患者Th17細(xì)胞的升高及Th