Th17-Treg失衡及其與中性粒細(xì)胞相互影響在ARDS發(fā)病中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種導(dǎo)致危重癥患者高病死率和致殘率的急性呼吸衰竭。雖經(jīng)大量基礎(chǔ)和臨床研究，ARDS的發(fā)病機(jī)制仍不明了，但無疑免疫炎癥細(xì)胞及其相關(guān)炎性介質(zhì)影響著ARDS的進(jìn)展及其預(yù)后。中性粒細(xì)胞(PMN)在肺部積聚、凋亡延遲以及凋亡后未被及時(shí)清除而引起的瀑式炎癥反應(yīng)，被認(rèn)為是引發(fā)ARDS的重要機(jī)制。但近年來，淋巴細(xì)胞，特別是CD4+T細(xì)胞在ARDS發(fā)病中的作用尤為引人關(guān)注。新近發(fā)現(xiàn)的促炎性CD4+T細(xì)胞亞

2、群，Th17細(xì)胞和抑炎性的Treg細(xì)胞間的平衡在眾多免疫炎癥性疾患中發(fā)揮著重要作用。而活化的PMN分泌大量炎癥因子，是調(diào)節(jié)Th17、Treg細(xì)胞分化的潛在新來源，反過來Th17、Treg細(xì)胞又可以影響PMN在炎癥部位的積聚、凋亡及其功能改變。本研究首先觀測(cè)Th17、Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子的變化，探討Th17/Treg失衡與ARDS患者肺損傷程度及臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)，明確Th17/Treg失衡在ARDS發(fā)病中的臨床意義;然后通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

3、觀察PMN對(duì)Th17/Treg平衡的影響，以及Th17、Treg細(xì)胞對(duì)PMN趨化、凋亡等功能的改變，探討PMN和Th17/Treg平衡相互影響在ARDS發(fā)病中的作用，從而闡述全身炎癥反應(yīng)引發(fā)ARDS時(shí)，固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)相互調(diào)控在ARDS發(fā)病中的作用，為揭示ARDS的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制并在此環(huán)節(jié)上進(jìn)行干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.以79例ARDS患者和26名健康志愿者為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞儀(FCM)、酶聯(lián)

4、免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)外周血Th17、Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子（IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1）的表達(dá)。收集研究對(duì)象人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床基線資料，同時(shí)記錄急性生理和慢性健康(APACHE)Ⅱ評(píng)分、序貫器官衰竭(SOFA)評(píng)分和肺損傷評(píng)分。主要結(jié)局定義為隨訪28天時(shí)ICU或者院內(nèi)病死率。
　　2.免疫磁珠法分離、純化PMN、初始CD4+T細(xì)胞、Th17和Treg細(xì)胞，并通過FCM及臺(tái)盼蘭染色后鏡檢上述細(xì)胞

5、的純度和活力。采用接觸共培養(yǎng)和Transwell體系培養(yǎng)，研究PMN對(duì)初始CD4+T細(xì)胞極化方向的影響及其機(jī)制。FCM檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1的含量， FCM和Western Blot檢測(cè)PMN細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類分子。采用Transwell小室培養(yǎng)研究PMN對(duì)Th17細(xì)胞的趨化作

6、用和相關(guān)機(jī)制。FCM檢測(cè)Th17細(xì)胞CCR2、CCR6受體的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)ARDS患者、正常對(duì)照組外周血中以及PMN細(xì)胞內(nèi)CCL2和CCL20的含量，觀察預(yù)先加或不加抗CCL2和CCL20的中和性單抗，PMN對(duì)Th17細(xì)胞趨化的影響。
　　3.應(yīng)用接觸共培養(yǎng)和Transwell體系培養(yǎng)，探討Th17、Treg細(xì)胞對(duì)PMN趨化、活性以及凋亡的影響和機(jī)制。ELISA法檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞內(nèi)IL-8、GM-CSF和IFN-

7、γ的含量，F(xiàn)CM檢測(cè)PMN細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)及其凋亡。在部分實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先加或不加抗IL-8、GM-CSF和IFN-γ的中和性單抗，觀察Th17細(xì)胞對(duì)PMN的趨化、活性和凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.ARDS患者外周血Th17、Treg細(xì)胞頻數(shù)以及Th17/Treg比值均較正常對(duì)照組明顯升高，隨ARDS患者肺損傷程度加重，Th17/Treg比值亦在輕、中、重度ARDS患者組中遞增。與正常對(duì)照組相比，Th17細(xì)胞相關(guān)性

8、細(xì)胞因子，IL-6和IL-17水平均明顯升高，而Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子，IL-10水平雖高于正常對(duì)照組，但TGF-β1水平在各組間無差異。Th17/Treg比值與APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分以及肺損傷評(píng)分均呈顯著正相關(guān)，而與氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)負(fù)相關(guān)。受試者工作特征曲線(ROC)分析發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg比值預(yù)測(cè)ARDS患者28d病死率的ROC曲線下面積高于APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分、急性肺損傷評(píng)分和PaO2/

9、FiO2。以＞0.79為截?cái)嘀担琓h17/Treg比值預(yù)測(cè)28d病死率的敏感性、特異性、陽性似然比和陰性似然比分別為87.5％、68.1％、2.74和0.18。Logistic回歸分析表明Th17/Treg比值是預(yù)測(cè)ARDS患者28d病死率的獨(dú)立變量(OR=8.68，p=0.002)。此外，Kaplan-Meier生存分析表明Th17/Treg比值＞0.79的ARDS患者有較高的28d病死率(Log-rank test，p＜0.001)

10、。
　　2.PMN和初始CD4+T細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)后，ARDS患者外周血PMN膜表面能顯著高表達(dá)MHCⅡ類分子，且培養(yǎng)體系中Th17細(xì)胞及其特異性轉(zhuǎn)錄因子（RORγt）和相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17、IL-6)的表達(dá)均明顯增加。而上述共培養(yǎng)結(jié)果，能被培養(yǎng)體系中預(yù)先加入抗MHCⅡ類分子的中和性抗體所拮抗。同時(shí)，未觀察到PMN對(duì)Treg細(xì)胞分化有影響。另外，ARDS患者外周血Th17細(xì)胞高表達(dá)CCR2、CCR6受體，其外周血和PMN細(xì)胞

11、內(nèi)CCL2和CCL20的含量亦較正常組高。與抗CCL2或/和CCL20的中和性單抗預(yù)培養(yǎng)后，PMN趨化Th17細(xì)胞的能力明顯受限。
　　3.ARDS患者外周血Th17細(xì)胞能較正常對(duì)照組顯著高表達(dá)IL-8、GM-CSF和IFN-γ。與抗IL-8中和性單抗預(yù)培養(yǎng)后，Th17細(xì)胞趨化PMN的效應(yīng)被完全阻斷。無論是直接接觸共培養(yǎng)還是Transwell體系培養(yǎng)，Th17細(xì)胞都能上調(diào)PMN表達(dá)膜蛋白CD11b，以及減少PMN凋亡，而上述效應(yīng)能

12、被抗GM-CSF和IFN-γ的中和性單抗預(yù)先與Th17細(xì)胞孵育后所拮抗。另外，Treg細(xì)胞對(duì)PMN無趨化作用。Treg細(xì)胞通過直接接觸共培養(yǎng)，而非Transwell體系培養(yǎng)，才能下調(diào)PMN表達(dá)CD11b，并促進(jìn)其凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.ARDS患者外周血中早期即有Th17、Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的變化，Th17/Treg比值與ARDS發(fā)病有關(guān)，并且較高的Th17/Treg比值是與更差的臨床預(yù)后相關(guān)聯(lián)。此外，重塑患者

13、體內(nèi)Th17/Treg平衡可能是個(gè)治療包括ARDS在內(nèi)的各種免疫炎癥性疾病的新的、有效策略。
　　2.PMN需與初始CD4+T細(xì)胞直接接觸并依賴MHCⅡ類分子途徑，才能促進(jìn)后者分化為Th17細(xì)胞。PMN還能釋放CCL2和CCL20趨化Th17細(xì)胞浸潤入肺，導(dǎo)致Th17/Treg平衡向促炎性Th17細(xì)胞優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化。
　　3.Th17細(xì)胞既能釋放IL-8趨化PMN，又可通過GM-CSF和IFN-γ增強(qiáng)PMN的活性和抑制其凋亡，使得