2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  下丘腦腹外側視前區(qū)(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)和結節(jié)乳頭體核(tuberomammillary nucleus,TMN)分別是公認的促睡眠中樞和促覺醒中樞,兩者以“此消彼長”相互制約的模式進行睡眠覺醒周期的調控。γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸是腦內參與睡眠覺醒調節(jié)的重要神經(jīng)遞質。為了進一步探究和闡述下丘腦腹外側視前區(qū)-結節(jié)乳頭體核調節(jié)睡眠覺醒周期的機制,本實驗通過多導睡眠

2、描記技術、腦立體定位微量注射技術、免疫組織化學等方法探討VLPO-TMN對大鼠睡眠-覺醒周期的影響及其調節(jié)的受體通路。
  方法:
  1.動物分組:根據(jù)實驗總體設計,大鼠用于三個部分:
  1.1 多導睡眠描記與分析:大鼠隨機分成對照組[VLPO和TMN內均微量注射人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF),即VLPO+ACSF& TMN+ACSF組]和實驗組Ⅰ(VLPO微量

3、注射 L-Glu同時TMN微量注射ACSF,即VLPO+L-Glu& TMN+ACSF組)、實驗組Ⅱ(VLPO微量注射L-Glu同時TMN微量注射Bic,即VLPO+L-Glu& TMN+Bic組)。
  1.2 檢測VLPO區(qū)域代謝型谷氨酸受體以及TMN核團GABAA受體表達。
  1.3 觀察興奮VLPO神經(jīng)元后TMN區(qū)域c-Fos表達量的變化:大鼠隨機分成對照組(VLPO微量注射ACSF,即VLPO+ACSF組)和實驗

4、組(VLPO微量注射L-Glu,即VLPO+L-Glu組)。
  2.動物模型建立選取健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠,體重280-300g。手術前準備好所需試劑以及儀器設備。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后將其頭部固定于腦立體定位儀上,暴露顱骨,根據(jù)大鼠腦定位圖譜把兩根不銹鋼中空引導管插入VLPO(AP:-0.36mm;R:1.30mm;H:-7.00mm)及TMN(AP:-3.96mm;R:1.50mm;H:-7.70

5、mm)用于核團內給藥,用牙科粘固粉將中空引導管和記錄電極固定于大鼠顱骨表面,再把引導腦電與肌電的電極用細銅線和微型插座相連接(上述操作步驟用于建立多導睡眠描記模型,觀察大鼠c-Fos表達變化的大鼠模型建立只需向VLPO內插入一根不銹鋼中空引導管用于微量給藥,同時省去上述電極與微型插座的操作),然后給予大鼠一定劑量抗生素(青霉素),縫合創(chuàng)口,最后放入隔音室中飼養(yǎng),保證飲水和食物充足,并隨時觀察大鼠恢復狀況。
  3.微量注射給藥用H

6、amilton微量注射器通過中空引導管向目的核團VLPO/TMN注射藥物或ACSF,注射速度為1?l/min,給藥完成將注射器停留1min防止藥液滲出。給藥時間為22:00-22:20(睡眠描記)和20:00-20:20(c-Fos表達量變化觀察)。
  4.多導睡眠描記分析數(shù)據(jù)記錄從給藥前2小時(20:00)開始,記錄時間為24小時。10秒為一個分段周期,將大鼠的睡眠覺醒周期分成:(1)覺醒期(wakefulness,W);(2

7、)快動眼睡眠期(rapid eye movement,REM);(3)非快動眼睡眠期(non-rapid eye movement,NREM);REM睡眠和NREM睡眠總和定為總睡眠時間(total sleep time,TST)。
  5.取材大鼠經(jīng)腹腔麻醉后,剪開胸腔并暴露心臟,持灌流針從心尖插入心臟經(jīng)左心室至主動脈,迅速剪開右心耳,快速注入生理鹽水約250ml,看到肝臟發(fā)白,再緩慢注入4%多聚甲醛約600ml,隨后斷頭并用止

8、血鉗小心撥開顱骨取出腦組織。用刀片切成0.5cm左右厚度,最后放入4%多聚甲醛固定6h。
  6.免疫組化檢測將包含目的核團的蠟塊切成厚度為4um的切片,烤片后用二甲苯脫蠟梯度酒精水化,使用免疫組化試劑盒進行受體染色,最后在顯微鏡下觀察染色情況。
  7.半定量分析TMN區(qū)域的c-Fos染色用累計光密度(integrated optical density,IOD)值反映蛋白表達水平。
  8.統(tǒng)計學處理采用SPSS1

9、7.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料用均數(shù)±標準誤(-x±s)表示,組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)以及t檢驗。檢驗水準P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
  結果:
  1. VLPO微量注射ACSF/L-Glu與TMN微量注射ACSF/Bic對大鼠腦電活動的影響
  1.1 與對照組VLPO+ACSF& TMN+ACSF組(n=8)相比,VLPO+L-Glu&TMN+ACSF組(n=7)大鼠VLP

10、O內微量注射L-Glu后從第二個小時起的兩個小時內,其覺醒減少42.2%(38.13±3.17,P<0.01),非快動眼睡眠(NREM)與總睡眠時間(TST)分別增加了89.5%(52.90±2.98,P<0.01)、80.5%(69.33±3.63,P<0.01),快動眼睡眠(REM)無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義;
  1.2 與VLPO+L-Glu& TMN+ACSF組(n=7)相比,VLPO+L-Glu& TMN+Bic組(

11、n=8)中GABA受體阻斷劑Bic和L-Glu分別相繼微量注射于TMN和VLPO,給藥后的第二、三個小時內大鼠的覺醒量增加了81.1%(66.12±3.26,P<0.01),REM睡眠和NREM睡眠以及TST分別減少了58.9%(4.94±1.02,P<0.05)、50.2%(39.62±2.93,P<0.01)、56.1%(47.11±4.14,P<0.01)。
  1.3 與VLPO+ACSF& TMN+ACSF組比較,VLP

12、O+L-Glu& TMN+Bic組的大鼠睡眠覺醒狀況未發(fā)生顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義。
  2.免疫組化結果
  2.1 mGluR5在 VLPO區(qū)域的表達與用PBS代替一抗的空白對照相比,mGluR5在VLPO區(qū)域陽性表達明顯,呈現(xiàn)棕黃色的強染色,定位于胞質膜,核呈藍色,細胞容易辨認,結構清晰,陽性對照表達良好。
  2.2 GABAARβ1在 TMN區(qū)域的表達與用PBS代替一抗的空白對照相比,TMN區(qū)域的 GABA

13、ARβ1為棕色或棕黃色陽性表達,定位于細胞膜,核呈藍色,細胞容易辨認,結構清晰,陽性對照表達良好。
  3.激動VLPO后TMN區(qū)域c-Fos蛋白表達的變化與對照組(53.98±2.02)相比,在VLPO腦區(qū)微量注射L-Glu后,檢測到大鼠的TMN區(qū)域c-Fos表達量(21.82±1.22)明顯減少,IOD值差異有統(tǒng)計學意義,軟件分析t=11.10(P<0.01)。
  結論:
  存在于VLPO和TMN的代謝型谷氨酸

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