HMGB1參與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管的生成及視網(wǎng)膜細胞凋亡以及HMGB1siRNA的干預作用.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變是一種糖尿病微血管病變，是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一。糖尿病視網(wǎng)膜病變是50歲以上工作人群重要的致盲眼病，近年來發(fā)病率不斷上升，在發(fā)展中國家的增長速度要高于發(fā)達國家。我國糖尿病患者中糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率高達44％-51.3％。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制十分復雜，至今尚未完全闡明。各種細胞因子在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
　　炎癥反應與糖尿病相關，HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質，參與糖尿病及其慢

2、性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。炎癥反應參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病過程已經(jīng)引起了許多學者的關注，糖尿病視網(wǎng)膜病變主要是微血管的病變，內(nèi)皮細胞和周細胞損傷引起細胞凋亡，血管視網(wǎng)膜屏障遭到破壞，血管滲漏性增加，導致了一系列炎癥反應及病理過程。HMGB1可由激活的免疫細胞、壞死細胞釋放到胞外，并與受體結合，通過激活核因子-κB的表達及增加其活性，誘導大量炎性反應介質的釋放。
　　細胞凋亡是由基因調控的主動死亡過程，其在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要

3、作用。糖尿病視網(wǎng)膜病變早期毛細血管細胞喪失機制為細胞凋亡。隨著凋亡細胞的數(shù)目增多，一些毛細血管發(fā)生閉塞，形成視網(wǎng)膜無灌注區(qū)，進而發(fā)展為無細胞毛細血管。糖尿病患者視網(wǎng)膜細胞凋亡的程度明顯高于非糖尿病患者。
　　高遷移率族蛋白B-1(high mobility group box-1，HMGB1)是一種幾乎存在于所有真核細胞內(nèi)的染色質非組蛋白核蛋白。
　　RNA干擾即將目的基因所對應的小分子雙鏈RNA導入生物體，導致相應的mRN

4、A降解，從而阻斷細胞中靶基因的表達。RNA干擾技術是目前新興的研究某個基因功能的有效方法。用干擾RNA特異性地抑制相關基因，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療疾病，這方面的研究有些已經(jīng)進入臨床試驗。
　　目的：
　　研究HMGB1參與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管的生成及視網(wǎng)膜細胞凋亡以及HMGB1siRNA的干預作用。
　　方法：
　　通過STZ腹腔注射方法成功建立糖尿病大鼠模型，觀察大鼠成模

5、情況及生理特點。進行大鼠視網(wǎng)膜細胞形態(tài)學檢測及凋亡情況檢測，觀察糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的病理學特點。視網(wǎng)膜組織石蠟切片免疫組化法檢測HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3、IL-2的表達和分布，western blot檢測蛋白表達量。設計靶向HMGB1的siRNA，進行大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)，然后通過慢病毒轉染的方法通過western blot手段在細胞中觀察siRNA對靶基因的抑制作用。DM16周大鼠按照自身對照的方

6、法分為對照組和干預組，行siRNA的玻璃體腔注射，視網(wǎng)膜組織切片TUNEL染色，western blot檢測HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3表達。
　　結果：
　　成功建立糖尿病大鼠模型，造模成功率98％。實驗前對照組和實驗組大鼠體重和血糖值無明顯差異(t=0.23，0.373，p＞0.05)。4w,8w,12w,16w時大鼠體重均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=13.252，17.739，26.35

7、6，14.116 P＜0.01)，血糖均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=23.578，25.941，28.429，20.959 P＜0.01)。糖尿病大鼠模型建立8周開始，實驗組大鼠中逐漸出現(xiàn)虹膜新生血管及白內(nèi)障。16時，共有13只鼠18只眼發(fā)生不同程度的白內(nèi)障。HE染色對照組大鼠視網(wǎng)膜組織病理結構正常，實驗組大鼠12周開始可見到毛細血管內(nèi)皮細胞突破內(nèi)界膜。16周時內(nèi)界膜腫脹、表面不平，視網(wǎng)膜節(jié)細胞層水腫。實驗前對照組大鼠與實驗組大

8、鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡情況無顯著差異(t=1.732，p＞0.05)。實驗組大鼠4w時RGC層可見少量TUNEL陽性細胞，16周時出現(xiàn)了血管內(nèi)皮細胞和周細胞的凋亡。與對照組相比，實驗組大鼠4w,8w,12w,16w時細胞凋亡指數(shù)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=7.201，3.372，11.496，12.186 P＜0.01)。
　　免疫組織化學結果顯示對照組不同時期視網(wǎng)膜內(nèi)HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3、IL

9、-2陽性細胞均較少，實驗組各組與對照組相比表達量增加，免疫組織化學結果與Western blot結果的蛋白表達趨勢基本吻合。Western blot示對照組大鼠視網(wǎng)膜HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3、IL-2蛋白表達強度均較低。HMGB1實驗組各時間點與對照組相比各因子表達強度增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.364，4.315，3.686，4.059，p＜0.05); NF-κB差異有統(tǒng)計學意義(t=3.065，5.

10、187，5.323，11.319，p＜0.05)，從8周開始統(tǒng)計學差異顯著(p＜0.01)。VEGF表達量4周、8周與對照組相比無差異(t=0.425，1.468，p＞0.05)，從12周開始顯著升高(t=4.688，6.041，p＜0.01)。Caspase-3實驗組各時間點與對照組相比各因子表達強度增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.3，3.57，4.01，4.794，p＜0.05)。IL-2實驗組各時間點雖較對照組相比均有升高(t=3

11、.521，2.118，9.656，5.89，p＜0.05)，但是升高趨勢沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化
　　大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)細胞貼壁，純化。Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學染色200×鏡下見大部分細胞均呈現(xiàn)陽性染色。
　　HMGB1siRNA轉染后視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞HMGB1蛋白表達量較對照組明顯降低(t=21.802，p＜0.01)。干預組凋亡細胞數(shù)明顯減少，凋亡指數(shù)與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=4.908，p＜0

12、.01)，尤其是GCL凋亡陽性細胞減少明顯。干預組大鼠視網(wǎng)膜HMGB1，NF-κB，VEGF和caspase-3蛋白表達量較對照組相比降低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.312，4.447，0.425，4.528，p＜0.05)
　　結論：
　　1、應用STZ腹腔注射方法能夠誘導穩(wěn)定的糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)新生血管生成和視網(wǎng)膜細胞凋亡的病理變化。
　　2、HMGB1在糖尿病視網(wǎng)膜中促進NF-κB的表達，促進