感覺神經(jīng)調控大鼠牙發(fā)育內穩(wěn)態(tài)的機制研究.pdf

1、內穩(wěn)態(tài)（homeostasis）[1]即內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，早期特指機體內環(huán)境的理化性質處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，如細胞外液、組織液、血液和淋巴的量在機體中處于相對恒定的狀態(tài)。隨著生命科學的發(fā)展，內穩(wěn)態(tài)的概念得到了擴展，可以指機體、器官、組織以及細胞通過神經(jīng)-體液-免疫系統(tǒng)共同作用，保持各種生理過程處于協(xié)調和穩(wěn)定的狀態(tài)。在組織和器官發(fā)育和維持內穩(wěn)態(tài)（homeostasis）的過程中，干細胞（stem cells）能夠通過動態(tài)調整其增殖和分化，形成高

2、度精確的復雜結構，如表皮、血液和小腸上皮中的干細胞能夠不斷分化出新的細胞，補充在正常組織更新（tissue turnover）中損失的細胞，這一過程稱為維持組織或器官的內穩(wěn)態(tài)。牙齒的形態(tài)發(fā)生和生長發(fā)育是神經(jīng)嵴源性上皮與外胚間充質相互作用的結果[2]，其發(fā)育模式（patterning）[3]在牙胚發(fā)育啟動時期已經(jīng)確定，因此牙胚是一個相對獨立的發(fā)育單元，其內穩(wěn)態(tài)的調控機制近年來逐漸成為口腔研究學者的關注熱點。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)[4]牙胚發(fā)育

3、早期，神經(jīng)源性信號分子可以調控間充質干細胞的增殖、遷移及分化；此外還發(fā)現(xiàn)[5]，神經(jīng)相關的膠質細胞不僅能夠定向分化為牙髓和成牙本質細胞，還在下切牙的損傷修復過程中發(fā)揮了重要作用。然而神經(jīng)在維持牙齒發(fā)育內穩(wěn)態(tài)的具體作用尚不甚清楚。嚙齒動物的下頜切牙根尖區(qū)上皮和間充質細胞不斷進行更新，使下切牙能夠終身不斷生長，是研究牙齒內穩(wěn)態(tài)的理想模型[6,7]。大量處于休眠期的上皮源性干細胞位于下切牙根頸環(huán)部分根尖蕾（apical bud）中；而間充質來

4、源的牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）則主要分布在牙髓組織中[8]。大鼠下切牙主要受感覺神經(jīng)纖維——下牙槽神經(jīng)(IAN)，和交感神經(jīng)纖維——頸上神經(jīng)節(jié)(SCG)發(fā)出的節(jié)后纖維支配[9,10]。因此，明確哪類神經(jīng)在牙發(fā)育中起主要支配作用將有助于我們更好的理解感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)在維持內穩(wěn)態(tài)和組織再生修復中的作用，目前未見明確的神經(jīng)調控牙齒內穩(wěn)態(tài)相關機制的報道。本研究擬通過建立單側大鼠下切牙失感覺和失交感神

5、經(jīng)模型，觀察牙的形態(tài)和組織學變化，進而檢測失神經(jīng)后大鼠牙髓干細胞的生物學行為，以期明確神經(jīng)能夠通過調控間充質干細胞的行為影響下切牙的內穩(wěn)態(tài)，進而分析神經(jīng)維持牙齒內穩(wěn)態(tài)的相關信號通路，探討神經(jīng)調控牙內穩(wěn)態(tài)的分子機制，以期為研究神經(jīng)維持組織器官內穩(wěn)態(tài)的作用模式提供研究基礎和實驗依據(jù)。
　　第一部分失神經(jīng)大鼠模型下切牙的形態(tài)組織學檢測實驗研究
　　目的：明確感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)在維持大鼠下切牙內穩(wěn)態(tài)中的作用。方法：建立失右側感覺神經(jīng)

6、(IANx)模型，失右側交感神經(jīng)（SCGx）模型和失右側感覺和交感神經(jīng)（IANx+SCGx）模型，同時設立假手術（Sham）組，2周后觀察下切牙形態(tài)學變化， Micro-CT和組織學染色檢測下切牙結構變化。結果：成功建立失感覺神經(jīng)模型（截斷下牙槽神經(jīng)）和失交感神經(jīng)模型（以上瞼下垂作為手術成功指征）；2周后， IANx組和IANx+SCGx組失神經(jīng)側下切牙發(fā)生明顯不透光的白堊色改變；Micro-CT檢測顯示，與Sham組相比，IANx組和

7、IANx+SCGx組下切牙髓腔中出現(xiàn)團塊狀不規(guī)則高密度影，釉質和牙本質厚度均減少（P＜0.01），兩組間無統(tǒng)計學差異，而SCGx組無明顯變化；HE和Masson染色顯示IANx組和IANx+SCGx組右側下切牙牙髓-牙本質復合體結構紊亂，髓腔內出現(xiàn)髓石，成牙本質細胞出現(xiàn)變性壞死，同時釉質和牙本質形成不全，兩組間無統(tǒng)計學差異，SCGx組與Sham組無明顯差異；免疫組化染色顯示IANx組和IANx+SCGx組下切牙生發(fā)中心-根尖蕾結構中Pc

8、na表達顯著減弱，此外，免疫組化和免疫熒光染色顯示，成牙本質細胞層 Dsp表達明顯降低，而 SCGx組無明顯變化。結論：截斷感覺神經(jīng)可以明顯影響牙齒形態(tài)結構的形成，提示感覺神經(jīng)在大鼠下切牙生長發(fā)育內穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了主要作用，而交感神經(jīng)無明顯作用。
　　第二部分感覺神經(jīng)維持大鼠牙髓干細胞生物學性能的實驗研究
　　目的：檢測及分析失感覺神經(jīng)后大鼠牙髓干細胞rDPSCs的生物學性能。方法：分別分離和培養(yǎng)失感覺神經(jīng)(IANx)2周后

9、的 rDPSCs和假手術（Sham）2周后的rDPSCs，采用流式細胞儀和細胞免疫熒光檢測干細胞表面分子標記物；計算克隆形成率比較克隆形成能力，CCK-8檢測細胞增殖能力；進行成骨、成脂的觀察和定量分析，同時通過qRT-PCR比較兩種細胞成骨、成脂分化相關基因的表達水平；使用細胞凋亡試劑盒檢測兩組細胞的細胞凋亡率。結果：分離培養(yǎng)的IANx組和Sham組rDPSCs能夠陽性表達MSC的標記物CD105和CD29，而不表達造血干細胞標記物C

10、D45，此外還表達神經(jīng)源性標記物GFAP；IANx組和Sham組rDPSCs均具有克隆形成能力和增殖能力，但IANx組rDPSCs的克隆形成率（8.61±0.62％）遠低于Sham組（16.22±0.49%）（P＜0.05），且增殖能力弱于Sham組（P＜0.05）；IANx組和Sham組rDPSCs都具有向成骨細胞和成脂細胞分化的能力，Sham組rDPSCs的成骨成脂能力均顯著高于IANx組（P＜0.05）；檢測IANx組rDPSCs

11、的細胞凋亡率（11.35±0.93%）明顯高于Sham組（6.22±1.05%）（P＜0.001）。結論：IANx組和Sham組rDPSCs均具有間充質干細胞的自我更新和多向分化能力，但IANx組rDPSCs的生物學性能明顯受損，提示感覺神經(jīng)在維持rDPSCs的正常生物學行為中發(fā)揮了重要作用，且這種作用不受細胞傳代的影響。
　　第三部分感覺神經(jīng)維持大鼠牙髓干細胞生物學性能的相關Wnt/β-Catenin信號通路機制的實驗研究

12、>　　目的：探討Wnt/β-Catenin信號通路在rDPSCs生物學行為中的作用，以期明確感覺神經(jīng)維持大鼠下切牙內穩(wěn)態(tài)中的具體機制。方法：qRT-PCR檢測第二部分IANx組和Sham組rDPSCs中Wnt/β-Catenin信號通路相關分子β-Catenin、Gsk-3β、Dkk1、Lrp5、Sfrp1和Wnt10a的基因表達水平；Western Blot檢測兩組細胞Wnt/β-Catenin信號通路關鍵蛋白β-Catenin和Gs

13、k-3β蛋白的表達水平；設置假手術組（Sham組）、失感覺神經(jīng)組（IANx組）和失感覺神經(jīng)組+激活劑氯化鋰（LiCl）組（IANx+ LiCl組），qRT-PCR和Western Blot檢測各組細胞Wnt/β-Catenin信號通路的表達水平；培養(yǎng)液中添加激動劑LiCl，激活失感覺神經(jīng)rDPSCs的Wnt/β-Catenin信號通路后，檢測其克隆形成能力、增殖能力、多向分化能力和細胞凋亡水平，并與IANx組和Sham組進行比較。結果：

14、qRT-PCR結果顯示，較Sham組rDPSCs，IANx組中Wnt10a表達量降低，抑制分子Dkk1的表達水平明顯升高，關鍵分子β-Catenin和Gsk-3β的基因表達量均無明顯差異；Western Blot檢測示，較Sham組rDPSCs，IANx組中關鍵分子active-β-Catenin和p-Gsk-3β的蛋白表達量均降低，但總蛋白量無明顯差異，提示失感覺神經(jīng)后，rDPSCs的Wnt/β-Catenin信號通路受到抑制；qRT

15、-PCR和Western Blot結果表明，LiCl處理后能激活細胞的Wnt/β-Catenin信號通路，但尚不能使之恢復至正常水平；IANx+ LiCl組的克隆形成率（13.49±1.16%）明顯升高，介于Sham組（16.22±0.86%）和IANx組（8.62±1.07%）之間（P＜0.05），增殖能力和成骨成脂分化能力均有一定程度回升（P＜0.05），同時，細胞凋亡率（8.29±0.94%）較 IANx組（11.35±0.93%