1-磷酸-鞘氨醇信號在小鼠感覺神經(jīng)節(jié)發(fā)育中作用的研究.pdf

1、1-磷酸-鞘氨醇(Sphingosine1-Phosphate S1P)是一種具有重要生物學(xué)活性的溶血磷脂,是一個在細(xì)胞生存,生長,分化,遷移等多個生物學(xué)過程中起到關(guān)鍵作用的信號分子。S1P是由鞘氨醇激酶(Sphk)催化鞘氨醇(Sphingosine,Sph)磷酸化而形成的,而神經(jīng)酰氨(Ceramide,Cer)在神經(jīng)酰胺酶(Ceramidase)的催化下去酰基產(chǎn)生鞘氨醇。Sphk有二種亞型,Sphk1和Sphk2。大量的研究顯示Sph

2、k1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具有重要作用。已知Cer,Sph與S1P的作用相反,S1P能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞的凋亡,而Cer,Sph則抑制細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Cer,Sph與S1P的代謝在腫瘤中通常是異常的。S1P一方面通過自分泌與旁分泌的方式與G-蛋白偶聯(lián)的S1P受體1-5結(jié)合,另一方面通過細(xì)胞內(nèi)第二信使途徑而調(diào)節(jié)細(xì)胞的上述功能。神經(jīng)脊細(xì)胞是一種多能性胚胎干細(xì)胞,是包括感覺神經(jīng)節(jié)在內(nèi)的多種組織的起源細(xì)胞。感覺神經(jīng)節(jié)包括脊神經(jīng)節(jié)

3、及腦神經(jīng)節(jié),它們將痛覺,機械刺激,本體感覺從周圍靶點傳遞到高級軀體感覺中樞。對于神經(jīng)脊細(xì)胞遷移到固定地點并開始增殖分化成感覺神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的基因調(diào)控機制至今還知之甚少。為了篩選與感覺神經(jīng)節(jié)發(fā)生相關(guān)的候選基因,通過cDNA宏陣列對比遷移早期的神經(jīng)脊細(xì)胞與遷移晚期開始增殖分化的神經(jīng)脊細(xì)胞的基因差異性表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)了一系列涉及不同基因路徑的基因在神經(jīng)脊細(xì)胞停止遷移后表達(dá)上調(diào),Sphk1是其中之一。Sphk1是催化S1P生成的關(guān)鍵酶,由此

4、推測S1P信號在胚胎感覺神經(jīng)節(jié)的發(fā)育中應(yīng)該具有一定的作用。
　　 研究目的：
　　 本研究通過檢測SphK1,SphK2以及S1P受體1-5在野生小鼠胚胎發(fā)育過程中的表達(dá),特別是在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的表達(dá),以確定它們表達(dá)的具體部位和所表達(dá)的細(xì)胞類型。通過敲除小鼠Sphk1和Sphk2基因,以探討S1P在胚胎發(fā)育特別是感覺神經(jīng)節(jié)發(fā)生中的作用,并進(jìn)一步明確S1P在感覺神經(jīng)節(jié)發(fā)育中的作用途徑。
　　 材料與方法:

5、>　　 1、通過整體胚胎、組織切片原位雜交及免疫熒光的方法檢測SphK1,SphK2,S1P受體1-5在野生小鼠胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)。
　　 2、通過基因打靶的方法敲除小鼠Sphk1和Sphk2基因使S1P水平降低到最低限度,以探討S1P在胚胎發(fā)育特別是感覺神經(jīng)節(jié)發(fā)生中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、Sphk1和Sphk2原位雜交結(jié)果顯示Sphk1在感覺神經(jīng)發(fā)育早期的神經(jīng)前體細(xì)胞中特異性表達(dá),并且隨著胚胎的發(fā)

6、育,部分神經(jīng)細(xì)胞也開始表達(dá)Sphk1。Sphk2在同階段的感覺神經(jīng)節(jié)中則無明顯表達(dá)。
　　 2、Sphk1和Sphk2基因敲除結(jié)果顯示單獨敲除它們中的任何一個基因,小鼠壽命正常,主要器官的組織學(xué)分析沒有發(fā)現(xiàn)與野生型有明顯差異。說明Sphk1和Sphk2之間的功能是互補的。為了把S1P水平控制在極低或零的水平,進(jìn)一步聯(lián)合敲除Sphk1和Sphk2基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sphk1和Sphk2基因聯(lián)合敲除小鼠胚胎不能存活超過E12.5天。在E

7、10.5天和E11.5天發(fā)現(xiàn)不同程度的感覺神經(jīng)節(jié)發(fā)育缺陷。脊神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)較小,神經(jīng)元形態(tài)不整,排列紊亂。用免疫熒光標(biāo)記SOXlO陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞,Islet1/2陽性的已分化的神經(jīng)細(xì)胞,Active-Caspase3陽性的凋亡細(xì)胞,和Phospho-histoneH3陽性的分裂期細(xì)胞。結(jié)果顯示E10.5天,Sphk1和Sphk2基因雙敲除小鼠脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少,而神經(jīng)前體細(xì)胞無明顯改變,E11.5天,Sphkl和Sphk

8、2基因聯(lián)合敲除小鼠三叉神經(jīng)節(jié)和脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)前體細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著性減少,細(xì)胞數(shù)的減少是由于凋亡細(xì)胞增加,增殖細(xì)胞減少而導(dǎo)致的。神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞都經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的過程。在Sphk1和Sphk2基因聯(lián)合敲除小鼠的S1P接近于0的同時,Cer和Sph的水平都有所下降,但是與野生型胚胎比較Cer/S1P和Sph/S1P的比值成千倍的增高?？梢奀er,Sph與S1P的比例嚴(yán)重失衡,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡凸顯。
　　 3、S1P受體1-5

9、原位雜交結(jié)果顯示S1pr2在遷移中的腦部神經(jīng)脊細(xì)胞和神經(jīng)脊細(xì)胞來源的腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)。S1pr1,Slpr4,S1pr5在胚胎發(fā)育過程中特別是發(fā)育晚期的神經(jīng)上皮和/或神經(jīng)節(jié)內(nèi)細(xì)胞都有一定程度的表達(dá)。S1pr3主要表達(dá)于圍繞神經(jīng)結(jié)構(gòu)的非神經(jīng)組織。沒有發(fā)現(xiàn)S1P五種受體中的任何一種在感覺神經(jīng)節(jié)發(fā)育的早期有特異性的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、Sphk1在脊神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)早期發(fā)育過程中的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)。