PAR4在初級感覺神經(jīng)元的表達及對TRPV1調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：蛋白酶活化受體4(PAR4)為G蛋白偶聯(lián)受體，參與多種病理生理的過程。最近研究發(fā)現(xiàn)PAR4在外周炎癥和疼痛調(diào)節(jié)中具有重要作用。以培養(yǎng)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)感覺神經(jīng)元為研究模型，研究PAR4在初級感覺神經(jīng)元的表達。觀察PAR4受體及其活化的細胞內(nèi)機制，以及與傷害性感覺受體瞬時電位香草酸受體亞型1(TRPV1)之間的相互關(guān)系，從而為進一步闡明PAR4參與外周痛信號的調(diào)節(jié)作用提供實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴以急性分離、培養(yǎng)大鼠

2、的DRG感覺神經(jīng)元為研究模型，利用免疫熒光的方法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，研究PAR4和TRPV1在體外培養(yǎng)的大鼠DRG感覺神經(jīng)元的表達以及兩者的共存。⑵Trizol裂解法提取培養(yǎng)的DRG感覺神經(jīng)元總RNA，用RT-PCR檢測PAR4基因的表達以及PAR4激動劑對PAR4和TRPV1基因表達的影響，及PKA信號通道對PAR4表達和PAR4介導(dǎo)TRPV1基因表達的調(diào)節(jié)作用。⑶RIPA細胞裂解液提取培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元總蛋白，檢測PAR4激動

3、劑對PAR4和TRPV1蛋白表達的影響以及PKA信號通道對PAR4表達和PAR4影響TRPV1蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：①年輕雄性Wistar大鼠，體重約100g，急性分離DRG，快速取雙側(cè)DRG，消化、吹打，制成細胞懸液，種置于六孔培養(yǎng)板觀察不同時間段細胞的數(shù)量，大小以及突起的長度。接種于六孔培養(yǎng)板的神經(jīng)細胞培養(yǎng)4小時作用，倒置顯微鏡下觀察，可見部分神經(jīng)細胞已貼壁，貼壁的神經(jīng)細胞為圓形或橢圓形，胞體周圍有一圈光暈，尚無

4、突起。神經(jīng)元的細胞核位于細胞中央或胞體一側(cè)，核仁明顯。接種24小時后，大部分細胞已貼壁，貼壁細胞長出小突起，除單個散布的神經(jīng)細胞外，常可見幾個或多個神經(jīng)細胞聚在一起，它們向四周發(fā)出樹枝狀突起。培養(yǎng)3-4天的神經(jīng)細胞的突起逐漸延長增粗，可看到神經(jīng)細胞的突觸交織在一起形成稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)細胞突起的主干和分枝都明顯延長并增粗，神經(jīng)細胞突起形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加稠密，神經(jīng)細胞胞體逐漸增大。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量會減

5、少。②免疫熒光組織化學結(jié)合激光共聚焦結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)細胞，可見大量的感覺神經(jīng)元表達PAR4，PAR4陽性神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)變化與上述體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元類似。培養(yǎng)1天的陽性細胞多為一些中小神經(jīng)元，直徑為11-28微米，也偶可見一些大型神經(jīng)元表達PAR4，形態(tài)呈圓形或橢圓形。培養(yǎng)24小時后，PAR4陽性神經(jīng)元生長突起出現(xiàn)，培養(yǎng)3-4天DRG神經(jīng)元可出現(xiàn)PAR4陽性軸突。陽性標記物主要出現(xiàn)在細胞膜、細胞漿，細胞核未見表達

6、。③在體外培養(yǎng)的大鼠DRG的神經(jīng)細胞，培養(yǎng)1天的TRPV1陽性細胞與PAR4陽性細胞相似，可見大量的中、小型TRPV1陽性神經(jīng)元胞體，形態(tài)呈圓形或卵圓形。TRPV1的陽性物分布于細胞膜、細胞漿，細胞核未見標記。DRG培養(yǎng)24小時后，可見TRPV1陽性的樹突和軸突。熒光雙標結(jié)合激光共聚焦結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元均可見PAR4/TRPV1雙標記。對30個培養(yǎng)孔蓋玻片上的DRG細胞計數(shù)顯示：有65.3％±3.2％(162/248)PA

7、R4陽性神經(jīng)元表達TRPV1，同樣，TRPV1陽性神經(jīng)元也表達PAR4，細胞計數(shù)有95％±2.4％(162/171)TRPV1陽性神經(jīng)元表達PAR4。④PAR4激動劑對PAR4在初級感覺神經(jīng)元表達的影響：將PAR4激動劑AYPGKF-NH2(10μM)加入培養(yǎng)的DRG神經(jīng)細胞內(nèi)作用1小時，Western blot結(jié)果顯示：PAR4激動劑使PAR4蛋白的表達量增加，加PAR4激動劑組與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RT-PC

8、R結(jié)果顯示：加PAR4激動劑組與空白對照組相比PAR4mRNA的表達量增加1.2倍，加PAR4激動劑組與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑤PKA激動劑和抑制劑對PAR4表達的影響：將PKA激動劑(forskolin1μM)和抑制劑(PHKI14-223μM)分別孵育培養(yǎng)的神經(jīng)細胞，作用30min后，再加入PAR4激動劑孵育1小時，Western blot結(jié)果顯示：加PKA激動劑和抑制劑組與加入PAR4激動劑組相比都使PAR4

9、蛋白表達量減少，但加PKA激動劑組的PAR4蛋白的表達量相對于加入PKA抑制劑的DRG神經(jīng)元PAR4表達減少，加入PKA抑制劑的PAR4蛋白的表達量與加入PKA激動劑組DRG神經(jīng)元PAR4表達增加。加入PKA激動劑和抑制劑組和空白對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：PKA激動劑組和PKA抑制劑組相比，加入PKA激動劑的PAR4mRNA的表達量減少，加入PKA抑制劑的PAR4mRNA的表達量增加。加入PKA激動

10、劑組與空白對照組相比PAR4mRNA的表達量減少，加入PKA抑制劑組與空白對照組相比PAR4mRNA的表達量增加1.17倍。加入PKA抑制劑組和空白對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑥PAR4激動劑對TRPV1表達的影響，將PAR4激動劑AYPGKF-NH2(10μM)加入培養(yǎng)的神經(jīng)細胞內(nèi)作用1小時，Western blot結(jié)果顯示：DRG神經(jīng)元TRPV1蛋白的表達量與空白對照組相比下降58％(n=3)，加PAR4激動劑組與空白

11、對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：PAR4激動劑使TRPV1mRNA的表達量減少與空白對照組相比下降20％(n=3)，加PAR4激動劑組與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：⑴體外培養(yǎng)的大鼠DRG初級感覺神經(jīng)元表達PAR4。許多PAR4陽性神經(jīng)元與TRPV1共存。⑵AYPGKF-NH2可上調(diào)PAR4蛋白和mRNA在DRG初級感覺神經(jīng)元的表達。PKA激動劑可抑制AYPGKF-NH2