希金斯刺盤孢侵染擬南芥的分子機(jī)制研究.pdf

1、由希金斯刺盤孢引起的炭疽病是十字花科蔬菜生產(chǎn)上的毀滅性病害之一。近年來，希金斯刺盤孢全基因組序列的公布和遺傳轉(zhuǎn)化體系的完善加速了希金斯刺盤孢致病相關(guān)基因的發(fā)掘和鑒定，同時也為從基因組水平上深入研究希金斯刺盤孢致病分子機(jī)制提供了新的平臺。本研究對希金斯刺盤孢致病缺陷突變體Ch-1-G281的ChRgf基因和突變體Ch-1-E240的ChAcs基因的功能進(jìn)行了研究，并觀察了希金斯刺盤孢侵染熒光標(biāo)記擬南芥植株寄主活體營養(yǎng)階段的亞細(xì)胞反應(yīng)，主要

2、結(jié)果如下:
　　(1)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建了希金斯刺盤孢Ch-1菌株的T-DNA插入突變體庫，獲得了2000個轉(zhuǎn)化子。通過將突變體分生孢子接種擬南芥植株，觀察接種第4天的發(fā)病癥狀及突變體侵染結(jié)構(gòu)的形成情況，篩選得到了7株致病缺陷型突變體，分別為致病喪失突變體Ch-1-G281及致病減弱突變體Ch-1-G090、Ch-1-G256、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240。通過South

3、ern雜交驗(yàn)證了7株致病缺陷型突變體的T-DNA插入拷貝數(shù)，其中Ch-1-G256、Ch-1-G281、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240為單拷貝插入，而Ch-1-G090為雙拷貝插入。通過Inverse-PCR對致病缺陷型的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得了7個T-DNA插入突變體的側(cè)翼序列。側(cè)翼序列分析結(jié)果顯示:突變體Ch-1-G281T-DNA插入破壞了RasGEF（Ch063_04179）基

4、因，該基因全長3057bp，編碼1018個氨基酸，有4個外顯子，3個內(nèi)含子。突變體Ch-1-G090T-DNA插入破壞了假定蛋白(Ch063_10682)基因，該基因全長543bp，編碼180個氨基酸，有1個外顯子;另一個插入位點(diǎn)破壞了RNA加工蛋白FCF1(Ch063_10671)，基因全長324bp，編碼108個氨基酸，有2個外顯子，1個內(nèi)含子。突變體Ch-1-G256T-DNA插入破壞了乳糖透過酶(Ch063_16024)基因，該

5、基因全長477bp，編碼159個氨基酸，有2個外顯子，1個內(nèi)含子。突變體Ch-1-G310T-DNA插入破壞了假定蛋白(Ch063_15059)基因，該基因全長243bp，編碼80個氨基酸，有1個外顯子。突變體Ch-1-G323T-DNA插入破壞了絲氨酸蘇氨酸激酶cot-1(Ch063_12968)基因，該基因全長1983bp，編碼660個氨基酸，有4個外顯子，3個內(nèi)含子。突變體Ch-1-G668T-DNA插入破壞了假定蛋白(Ch063

6、_01887)基因，該基因全長645bp，編碼214個氨基酸，有1個外顯子。以及突變體Ch-1-E240T-DNA插入破壞了乙酰輔酶A合成酶（Ch063_08070）基因，該基因全長1275bp，編碼424個氨基酸，有4個外顯子，3個內(nèi)含子。
　　(2)T-DNA插入突變體Ch-1-G281在PDA上的菌落形態(tài)變化較大，其菌絲生長速度變慢，菌絲呈多分支狀。突變體分生孢子產(chǎn)量降低，孢子液噴霧接種擬南芥葉片后，分生孢子不能在葉片表面正

7、常萌發(fā)產(chǎn)生黑化的附著胞，推測該基因影響了分生孢子的萌發(fā)以及附著胞的形成。證實(shí)T-DNA插入破壞了Ras鳥氨酸交換因子（ChRgf)，ChRgf基因全長為3276bp，編碼1018個氨基酸。敲除ChRgf基因影響了希金斯刺盤孢的營養(yǎng)生長和菌絲形態(tài)，敲除轉(zhuǎn)化子⊿ChRgf-42生長緩慢，菌絲呈現(xiàn)多分枝;產(chǎn)孢量顯著下降，僅為野生型的8％;在塑料玻片上誘導(dǎo)孢子萌發(fā)，孢子萌發(fā)率明顯降低，為野生型的50％，萌發(fā)的孢子不能正常形成附著胞，而附著胞產(chǎn)率

8、約為野生型及互補(bǔ)突變體的5-10％，而附著胞膨壓與野生型菌株并無明顯差異。敲除轉(zhuǎn)化子⊿ChRgf-42孢子液噴霧接種擬南芥葉片后，敲除轉(zhuǎn)化子⊿ChRgf-42分生孢子不能在葉片表面萌發(fā)并產(chǎn)生黑化的附著胞。敲除轉(zhuǎn)化子⊿ChRgf-42孢內(nèi)cAMP含量顯著降低，僅為野生型胞內(nèi)cAMP含量的60％，外源加入cAMP以及IBMX可使敲除轉(zhuǎn)化子⊿ChRgf-42對外界疏水信號產(chǎn)生響應(yīng)。敲除轉(zhuǎn)化子⊿ChRgf-42對外界脅迫如NaC1，KCl的耐受

9、性增強(qiáng)?；蚧パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因敲除菌株的產(chǎn)孢、萌發(fā)、附著胞形成及致病性均恢復(fù)至野生菌株水平。表明希金斯刺盤孢ChRg基因作為cAMP，Ras等通路的上游調(diào)控因子在調(diào)控營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢以及致病相關(guān)的侵染結(jié)構(gòu)的發(fā)育等方面具有重要的生物學(xué)功能。
　　(3)T-DNA插入突變體Ch-1-E240在菌絲生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)及附著胞形成等方面與出發(fā)菌株Ch-1相比沒有顯著差異。孢子液噴霧接種擬南芥植株后擬南芥植株發(fā)病嚴(yán)重度低于野生型，顯微觀

10、察表明分生孢子在葉片表面正常萌發(fā)產(chǎn)生黑化的附著胞，能正常侵染產(chǎn)生初生菌絲，但次生菌絲產(chǎn)量明顯降低，推測該基因影響了次生菌絲的產(chǎn)生。T-DNA插入破壞了乙酰輔酶A合成酶基因(ChAcs1)，ChAcs1基因全長為1441bp，編碼432個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，希金斯刺盤孢中有兩個乙酰輔酶A合成酶編碼基因，分別命名為ChAcs1(Ch063_08070)和ChAcs2(Ch063_00691)，采用基因敲除和互補(bǔ)策略，分別對這兩個基因

11、進(jìn)行了功能分析:ChA cs1基因敲除對希金斯刺盤孢的營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢和附著胞的形成與野生型無明顯差異;ChAcs2基因敲除無明顯的表型改變。通過GFP融合表達(dá)及蛋白定位分析，發(fā)現(xiàn)ChAcs1蛋白、ChAcs2蛋白的表達(dá)分布于整個細(xì)胞質(zhì)。⊿Chacs1不能利用乙醛、乙醇、乙酸等非發(fā)酵碳源，胞內(nèi)脂質(zhì)含量下降。⊿Chacs1敲除轉(zhuǎn)化子接種擬南芥葉片4天后，植株發(fā)病嚴(yán)重度低于野生型，只有47％的初生菌絲能正常發(fā)育并形成次生菌絲;而⊿Chacs2

12、敲除轉(zhuǎn)化子對致病性無明顯影響。對⊿Chacs1敲除轉(zhuǎn)化子接種擬南芥活體營養(yǎng)階段（侵染40小時后）進(jìn)行全基因組RNA-seq分析，表明ChAcs1參與調(diào)控了一系列與致病、乙醇代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)以及乙醛酸循環(huán)相關(guān)的基因，致病相關(guān)基因如MAPK，STE7等基因下調(diào)表達(dá)，乙醇代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)中重要節(jié)點(diǎn)基因如乙醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶等基因下調(diào)表達(dá)?；蚧パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因敲除菌株的致病性恢復(fù)至野生菌株

13、水平。以上結(jié)果表明ChAcs1可能參與調(diào)控了丙酮酸-乙醛-乙酸代謝途徑，在調(diào)控脂類代謝、致病相關(guān)侵染結(jié)構(gòu)如次生菌絲的形成等方面具有重要的生物學(xué)功能。
　　(4)用希金斯刺盤孢侵染不同熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，以研究擬南芥與希金斯刺盤孢互作過程中的活體營養(yǎng)界面的膜區(qū)室的重分布。在活體營養(yǎng)寄生階段，寄主細(xì)胞的質(zhì)膜蛋白表現(xiàn)出不同的定位模式，肉豆蔻?；妥貦磅；鞍譓AP，異戊二烯蛋白PAP，低溫誘導(dǎo)蛋白LTI6b均定位于活養(yǎng)寄生界

14、面，突觸融合蛋白PEN1與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PEN3定位于初級初生菌絲的活養(yǎng)寄生界面，質(zhì)膜H+-ATP酶PMA與質(zhì)膜固有蛋白PIP2定位于初生菌絲的基部。與此同時，寄主細(xì)胞細(xì)胞膜脂也在初生菌絲侵染階段呈現(xiàn)出不同的定位模式:磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P定位于初生菌絲的基部，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸PI(4，5)P2定位于活體營養(yǎng)界面，磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌絲的活養(yǎng)寄生界面。同時磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌絲的活

15、養(yǎng)界面說明液泡也參與了活養(yǎng)界面的合成以及互作。后期由不同的液泡膜標(biāo)記蛋白包括液泡膜水通道蛋白以及囊泡相關(guān)蛋白VAMP711均包裹初生菌絲界面，證明了液泡參與初生菌絲界面的互作過程。隨著初生菌絲的發(fā)展，液泡逐漸變小，直至液泡膜破裂，與此同時，粗大的初生菌絲向細(xì)長的次生菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)化，說明寄主細(xì)胞死亡與液泡的破裂以及初生菌絲向次生菌絲轉(zhuǎn)變是同一時間點(diǎn)發(fā)生的。此外，內(nèi)吞囊泡ARA7/RABF2b單一定位于初生菌絲的活體營養(yǎng)界面說明寄主細(xì)胞的內(nèi)吞