希金斯刺盤(pán)孢T-DNA插入體庫(kù)的篩選及相關(guān)突變體基因的克隆.pdf

1、由希金斯刺盤(pán)孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一類(lèi)重要的世界性植物真菌病害，該菌分類(lèi)地位屬于真菌門(mén)，半知菌亞門(mén)，炭疽菌屬。本實(shí)驗(yàn)室以希金斯刺盤(pán)孢Ch-1菌株為出發(fā)菌株，已經(jīng)成功建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系并獲得4500多個(gè)T-DNA隨機(jī)插入突變體。通過(guò)培養(yǎng)性狀和將突變體分生孢子液分別接種活體和離體擬南芥葉片，并以野生型為對(duì)照，比較其致病力差異；同時(shí)在塑料玻片上觀察突變體分生孢

2、子是否正常形成附著孢的篩選方法，篩選了638株突變體，得到1株致病力喪失轉(zhuǎn)化子(Pch-1830)，2株致病力減弱轉(zhuǎn)化子(Pch-1E240和Pch-1E590)，1株生長(zhǎng)緩慢轉(zhuǎn)化子(Pch-1E409)，1株產(chǎn)泡狀菌絲轉(zhuǎn)化子(Pch-1E808)，1株產(chǎn)類(lèi)似厚垣孢子轉(zhuǎn)化子(Pch-1E43)和52株菌落白化轉(zhuǎn)化子(Pch-1E101等)。
　　 Pch-1830菌株不能使健康或針刺造成傷口的擬南芥離體或活體葉片發(fā)病，接種擬南芥

3、葉片4d，只能觀察到正常的附著胞及極少數(shù)出生菌絲，沒(méi)有次生菌絲的形成。Southern雜交證實(shí)在Pch-1830T-DNA標(biāo)記為雙拷貝插入。采用反向PCR技術(shù)對(duì)突變體Pch-1830中T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列進(jìn)行克隆，經(jīng)過(guò)序列分析，其中一個(gè)T-DNA插入破壞的基因包含一個(gè)4612bp的完整開(kāi)放閱讀框，包含三個(gè)內(nèi)含子、四個(gè)外顯子，編碼991個(gè)氨基酸蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比(blastp)，發(fā)現(xiàn)該序列與綠僵菌

4、(Metarhizium anisopliae)的DUF221(Domain of unknownfunction)具有高度同源相似性，相似度為98%，此蛋白功能未知。另一個(gè)T-DNA插入破壞的基因包含一個(gè)694bp的完整開(kāi)放閱讀框，包含一個(gè)內(nèi)含子、兩個(gè)外顯予，編碼208個(gè)氨基酸蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比(blastp)，發(fā)現(xiàn)該序列與禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的外切體構(gòu)件EKOSC1/CS

5、L4(exosome component)具有高度同源相似性，相似度為86%，此蛋白是一種復(fù)雜的外切體亞基，其功能是正確處理去除錯(cuò)誤RNA和基因正常水平的維護(hù)?；虮磉_(dá)試驗(yàn)表明DUF221基因在突變體Pch-1830菌絲培養(yǎng)過(guò)程中不表達(dá)。
　　 Pch-1E240菌株株不能使健康擬南芥離體或活體葉片發(fā)病，但能使針刺的擬南芥葉片發(fā)病。顯微觀察發(fā)現(xiàn)該菌株接種健康擬南芥葉片4d，能正常形成附著胞、初生菌絲，但沒(méi)有形成次生菌絲。Sout

6、hern雜交證實(shí)在Pch-1E240 T-DNA標(biāo)記為單拷貝插入。采用反向PCR技術(shù)對(duì)突變體Pch-1E240中T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列進(jìn)行克隆，經(jīng)過(guò)序列分析，表明T-DNA插入破壞的基因其中一份包含一個(gè)2646bp的完整開(kāi)放閱讀框，包含五個(gè)內(nèi)含子、六個(gè)外顯予，編碼669個(gè)氨基酸蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比(blastp)，發(fā)現(xiàn)該序列與禾生炭疽菌(Glomerellagraminicola)的乙酸輔酶A連接酶

7、(Acetate-Coa Ligase)具有高度同源相似性，相似度為98%，乙酰輔酶A是能源物質(zhì)代謝的重要中間代謝產(chǎn)物，是一個(gè)樞紐性的物質(zhì)。
　　 Pch-1E590菌株接種健康的擬南芥葉片4d仍無(wú)發(fā)病癥狀，但能使刺傷或幼嫩的葉片正常發(fā)病，顯微觀察，能正常產(chǎn)生附著胞、初生菌絲、次生菌絲。Southern雜交驗(yàn)證該菌株T-DNA插入拷貝數(shù)為雙拷貝。采用反向PCR技術(shù)對(duì)突變體Pch-1E590中T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列

8、進(jìn)行克隆，僅獲得了一端基因序列，經(jīng)過(guò)序列分析，表明該T-DNA未插入到含有完整開(kāi)放閱讀框的基因中。
　　 在篩選過(guò)程中還獲得了1株生長(zhǎng)緩慢轉(zhuǎn)化子Pch-1E409。Southern雜交證實(shí)在T-DNA標(biāo)記為單拷貝插入。采用反向PCR技術(shù)對(duì)Pch-1BE409中T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列進(jìn)行克隆，經(jīng)過(guò)序列分析，表明T-DNA插入破壞的基因其中一份包含一個(gè)1947bp的完整開(kāi)放閱讀框，包含三個(gè)內(nèi)含子、四個(gè)外顯子，編碼57