粘多糖?、蛐突颊吣蛞旱鞍踪|(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：通過(guò)研究尿液中與粘多糖?、蛐?mucopolysaccharidosis typeⅡ，MPSⅡ)相關(guān)的差異蛋白質(zhì)組：1.篩選MPSⅡ型的分子標(biāo)志物，幫助疾病診斷;2.尋找MPSⅡ型所影響的信號(hào)通路，為致病機(jī)制的闡明提供研究依據(jù)。
　　方法：選取2015年3月～2016年6月在解放軍總醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心確診的MPSⅡ型患者12例納入疾病組，同時(shí)選取本院健康查體人員15例納入健康對(duì)照組，留取晨尿。1.將MPSⅡ型組和健康對(duì)照組分別

2、隨機(jī)選取6例標(biāo)本混合，通過(guò)雙向凝膠電泳(two dimensional gel electrophoresis，2-DE)分離尿液中總蛋白，然后運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)鑒定差異蛋白種類。2.從中選擇α1-抗胰蛋白酶(α1antilrypsin，α1-

3、AT)、神經(jīng)節(jié)苷脂酶激活因子(Gm2activator protein，GM2A)、維生素D結(jié)合蛋白(vitamin D-binding protein，DBP)和前列腺素D合成酶(lipocalin-type prostaglandin D synthase，L-PGDS)四種蛋白，運(yùn)用ELISA和Western Blot方法檢測(cè)其在MPSⅡ型組和健康對(duì)照組個(gè)體尿液中的含量，分析差異性。3.采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobari

4、c tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術(shù)標(biāo)記MPSⅡ型組和正常對(duì)照組混合尿液中蛋白，運(yùn)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS)法檢測(cè)蛋白種類和含量，然后利用Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and

5、 Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：1.通過(guò)2-DE方法檢測(cè)出32個(gè)差異蛋白點(diǎn)，運(yùn)用MALDI-TOF-MS技術(shù)共鑒定出20種差異蛋白，其中AAT、DBP、溶酶體葡糖苷酶前體等10種蛋白表達(dá)上調(diào)，GM2A、L-PGDS、免疫球蛋白κ輕鏈1等10種蛋白表達(dá)下調(diào)。2.用ELISA方法測(cè)得MPSⅡ組α1-AT/Cr比值為(55.89±7.43)mg/mmol，對(duì)照組α1-AT/Cr比值為(33.32±3.5

6、9)mg/mmol，MPSⅡ組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);MPSⅡ組GM2A/Cr比值為(1.31±0.14)ng/mmol，對(duì)照組GM2A/Cr比值為(2.68±0.44)ng/mmol，MPSⅡ組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)MPSⅡ組DBP/Cr比值為(0.35±0.06)ng/mmol，對(duì)照組DBP/Cr比值為(0.14±0.02)ng/mmol，MPSⅡ組顯著高于對(duì)照組;MPSⅡ組L-PGDS/Cr比值為(8.02±2.0

7、4)pg/mmol，對(duì)照組L-PGDS/Cr比值為(18.14±1.67)pg/mmol，MPSⅡ組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。運(yùn)用Western Blot方法檢測(cè)疾病組與對(duì)照組中α1-AT和GM2A含量，通過(guò)條帶灰度差異可判斷，疾病組尿液中α1-AT含量明顯升高，GM2A含量明顯減低。3.采用iTRAQ技術(shù)，聯(lián)合LC-MS/MS，對(duì)MPSⅡ型患者和正常對(duì)照組尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出693種差異蛋白，其中疾病組中表達(dá)上調(diào)的2