尿液蛋白質組學在IgA腎病激素治療前后的比較.pdf

1、目的:研究初次診斷為IgA腎病(ImmunoglobulinAnephropathy)患者應用激素治療前后尿液蛋白質質譜特點，篩選出IgA腎病患者可能的差異性蛋白;同時對激素的療效進行評估，探討尿蛋白質組學對疾病動態(tài)監(jiān)測的意義。
　　 方法:留取健康人(n=6)、新診斷為IgA腎病并滿足應用激素治療的患者(n=6)激素治療前后（應用激素治療1個月后）的空腹狀態(tài)下清潔中段晨尿標本，為避免細菌滋長和蛋白質酶解于1小時內放置于-80℃

2、冰箱保存?zhèn)溆?。首先取?8份尿標本，待常溫下完全溶解后將樣品放于離心機中，以4℃1500g×10minutes離心，取上清以去除尿液中的細胞碎片，然后將所取上清以4℃10000g×10minutes再次離心沉淀，以去除尿液中的其他微粒，取上清，用-20℃預冷過的有機溶劑（有機溶劑為乙醇與丙酮按體積1∶1配制）按照標本體積與有機溶劑體積比為4∶1進行蛋白質沉淀，置于-20℃過夜后，經(jīng)4℃25000×g離心30分鐘，棄上清液，將含尿液蛋白質

3、的沉淀物真空干燥濃縮并存于-20℃待用。濃縮干燥的尿蛋白沉淀物用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)充分溶解后，用考馬斯亮藍染色法(Bradford)測定每份樣品中尿蛋白濃度，稱取每例樣品含1mg蛋白質的混合固體，充分溶解后使用高效液相色譜法（C18吸附柱）除鹽，測的肽峰，獲取峰面積及含肽的混合溶液，真空干燥，最后將干燥后的樣品充分酶解，并將個樣品的的蛋白濃度調整為1μg/μl后進行HPLC-ESI-MS/MS分析，獲得的尿液蛋白質多肽序列應用Ma

4、scotDaemon軟件進行數(shù)據(jù)檢索，應用庫為ipi_hunman_v3.71_reverse.fasta，所獲得的人尿蛋白序列號在Uniprot數(shù)據(jù)庫中檢索，查詢目標蛋白質的名稱、作用等相關信息。
　　 結果:1.6份健康人的尿液樣品中共鑒定出98種蛋白質，經(jīng)手工驗證后，所有健康人的尿液樣品共同表達29種蛋白質;
　　 2.6份新診斷為IgA腎病患者激素治療前的尿液樣品中共鑒定出165種蛋白質，所有IgA腎病患者激素治

5、療前的尿液樣品共同表達11種蛋白質;將這11種蛋白質與健康人尿液所表達的蛋白質進行比較，從中手工剔除相同蛋白質，特異性表達10種蛋白，它們是:免疫球蛋白重鏈v-iii區(qū)（IgheavychainV-ⅢregionTEI）、Igγ2鏈C區(qū)（Iggamma-2chainCregion）、a-1抗胰糜乳蛋白酶（Alpha-1-antichymotrypsin）、a-1抗胰蛋白酶（Alpha-1-antitrypsin）、維生素D結合蛋白(Vi

6、taminD-bindingprotein)、血紅蛋白β鏈(Hemoglobinsubunitbeta)、免疫球蛋白IgG輕鏈(IGL@protein)、血漿銅藍蛋白(Ceruloplasmin)、IGK@protein、Anti-(ED-B)scFV和血清鐵傳遞蛋白（Serotransferrin）
　　 結論:1.本實驗利用HPLC—ESI—MS/MS技術研究了IgA腎病患者的尿液蛋白質譜特點，共得到165種蛋白質，并與健康

7、人尿液中表達的蛋白進行比較，手工剔除相同的蛋白質，IgA腎病患者尿液中特異性表達的蛋免疫球蛋白重鏈v-iii區(qū)(IgheavychainV-ⅢregionTEI)、Igγ2鏈C區(qū)(Iggamma-2chainCregion)、a-1抗胰糜乳蛋白酶（Alpha-1-antichymotrypsin）、a-1抗胰蛋白酶（Alpha-1-antitrypsin）、維生素D結合蛋白(VitaminD-bindingprotein)、血紅蛋白β鏈