干細胞微囊泡緩解實驗性結(jié)腸炎及其相關(guān)腸纖維化和復方苦參湯的協(xié)同作用研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 骨髓間充質(zhì)干細胞來源微囊泡的鑒定
　　目的：大鼠全骨髓貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，經(jīng)血清饑餓處理，收集并鑒定BMSCs來源的MVs，為后續(xù)試驗打下基礎(chǔ)。
　　方法：取體重80-100g的SD大鼠，于無菌條件下分離脛骨、股骨，體外分離、培養(yǎng)并純化BMSCs，流式細胞學鑒定。得到

2、的BMSCs經(jīng)血清饑餓處理，將其上清液低溫超速離心，獲得BMSCs來源的MVs，并用電鏡及流式細胞學鑒定。
　　結(jié)果：全骨髓貼壁法得到呈旋渦狀排列的梭形 BMSCs，生長狀況良好，流式細胞學鑒定其高表達CD90和CD29，不表達CD45和CD11b。BMSCs來源的MVs在電鏡下呈圓形或橢圓形的囊狀結(jié)構(gòu)，其直徑大約在500nm左右，經(jīng)流式細胞學鑒定MVs大小與理論值相符。
　　結(jié)論：全骨髓貼壁法可以獲得生長狀態(tài)良好，純度較高

3、的 BMSCs，經(jīng)流式細胞學鑒定滿足BMSCs特征。血清饑餓處理合并低溫超速離心的方法，可以得到狀態(tài)穩(wěn)定的MVs，經(jīng)電鏡及流式細胞學鑒定其大小形態(tài)符合MVs特征。
　　第二部分 干細胞微囊泡對實驗性結(jié)腸炎的治療及復方苦參湯的協(xié)同作用研究
　　目的：研究BMSCs來源MVs在抗炎、抗氧化以及抗凋亡方面對2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的IBD大鼠模型的治療作用以及復方苦參湯的協(xié)同效應。
　　方法：體重在160-1

4、80g左右的SD大鼠，隨機分為4組：正常對照組、模型組、MVs組和 MVs+中藥組（MVs+TCM組，二聯(lián)組）。采用 TNBS/乙醇灌腸，構(gòu)建實驗性結(jié)腸炎大鼠模型。對各組大鼠一般情況及疾病活動指數(shù)進行評估，免疫組化、western blot及PCR等方法檢測結(jié)腸核因子ΚB（NF-ΚB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、白介1β（IL-1β）、白介10（IL-10）等炎癥反應相關(guān)分

5、子，髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）等氧化應激相關(guān)分子，以及剪切后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（c-caspase3），剪切后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8（c-caspase8），剪切后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（c-caspase9）等凋亡相關(guān)分子的表達情況。
　　結(jié)果：在炎癥性指標方面，與模型組相比，MVs組和二聯(lián)組可以顯著降低NF-ΚB,TNF-

6、α,iNOS,COX-2等炎性介質(zhì)的mRNA和蛋白的表達，降低IL-1β蛋白的表達，升高抗炎因子IL-10的水平。在氧化應激反應相關(guān)指標方面，與模型組相比， MVs組和二聯(lián)組可以降低氧化介質(zhì)MPO和MDA的表達，升高抗氧化介質(zhì)GSH和SOD的表達水平。在凋亡相關(guān)指標方面，與模型組相比，MVs組和二聯(lián)組可以降低 c-caspase3，c-caspase8，c-caspase9的表達。且各指標中，二聯(lián)組效果均優(yōu)于MVs組。
　　結(jié)論：

7、MVs可以從抗炎、抗氧化、抗凋亡三個反面緩解TNBS誘導的實驗性結(jié)腸炎，復方苦參湯在MVs對實驗性結(jié)腸炎的治療作用中起到協(xié)同作用。
　　第三部分 過表達 miR-200b的干細胞微囊抑制實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的細胞外基質(zhì)沉積及復方苦參湯的協(xié)同作用研究
　　目的：初步探討過表達miR-200b的干細胞來源MVs對實驗性結(jié)腸炎相關(guān)性纖維化的細胞外基質(zhì)沉積的抑制效果，以及復方苦參湯的協(xié)同治療作用。
　　方法：構(gòu)建過表達mi

8、R-200b的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染第四代BMSCs，經(jīng)藥篩得到穩(wěn)定過表達miR-200b的BMSCs，將這些細胞經(jīng)血清饑餓處理后，低溫超速離心其上清液，得到過表達miR-200b的干細胞MVs（下文簡稱：miR-200b-MVs），并經(jīng)PCR鑒定其miR-200b的表達水平。大鼠被隨機分為5組：正常組、模型組、null-MVs組（陰性病毒轉(zhuǎn)染的干細胞產(chǎn)生的MVs）、miR-200b-MVs組（過表達miR-200b的慢病毒轉(zhuǎn)染干細胞產(chǎn)生的M

9、Vs），和miR-200b-MVs+中藥復方苦參湯組（二聯(lián)組）。采用 TNBS/乙醇多次灌腸法誘導實驗性結(jié)腸炎相關(guān)性腸纖維化模型。每組予以相應的處理，6周后收取結(jié)腸組織進行病理學分析， western blot檢測細胞外基質(zhì)相關(guān)指標纖連蛋白（ fibronectin）、Ⅰ型膠原（collagenⅠ）、Ⅲ型膠原（collagenⅢ）的表達。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建過表達miR-200b的慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染BMSCs，并成功獲得穩(wěn)定過表

10、達 miR-200b的干細胞 MVs。與正常組相比，模型組 fibronectin、collagenⅠ、collagenⅢ的表達明顯升高；與模型組相比，微囊泡組、miR-200b-MVs組和二聯(lián)組都可以降低fibronectin、collagenⅠ、collagenⅢ的表達水平，其中以二聯(lián)組的效果最佳。
　　結(jié)論：miR-200b-MVs可以減少實驗性結(jié)腸炎相關(guān)性纖維化的細胞外基質(zhì)沉積，復方苦參湯具有協(xié)同治療作用。
　　第四

11、部分 過表達 miR-200b的干細胞微囊泡通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化緩解實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化及復方苦參湯的協(xié)同作用研究
　　目的：進一步探討miR-200b-MVs通過抑制EMT緩解實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的作用機制及作用靶點。
　　方法：分為動物實驗和細胞實驗兩部分；在動物實驗部分，將大鼠隨機分為正常組、模型組、null-MVs組（陰性病毒轉(zhuǎn)染干細胞得到的MVs）、miR-200b-MVs組（過表達 miR-200b的慢

12、病毒轉(zhuǎn)染干細胞后得到的 MVs）、miR-200b-MVs+中藥復方苦參湯組（以下簡稱：二聯(lián)組）。用 TNBS/乙醇多次灌腸的方法構(gòu)建實驗性結(jié)腸炎相關(guān)性腸纖維化模型，western blot檢測EMT相關(guān)蛋白E-cad、波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、ZEB1和ZEB2的表達情況，免疫熒光檢測E-cad、成纖維細胞特異蛋白（FSP-1）和α-SMA的表達。在細胞實驗中，細胞分為正常組、模型組、null-MV

13、s組、miR-200b-MVs組。用細胞因子生長轉(zhuǎn)化因子β（TGF-β）刺激大鼠小腸上皮隱窩細胞株（IEC-6），構(gòu)建EMT模型，加入null-MVs或miR-200b-MVs后，觀察細胞形態(tài)改變，western blot檢測細胞E-cad，vimentin，ZEB1和ZEB2的表達情況。兩部分都用PKH26染色過的null-MVs和miR-200b-MVs，來觀察null-MVs和miR-200b-MVs在結(jié)腸的定植情況，以及null

14、-MVs或miR-200b-MVs與IEC-6細胞的融合情況。
　　結(jié)果：在動物實驗部分，發(fā)現(xiàn)通過追蹤PKH26標記過的MVs和miR-200b-MVs發(fā)現(xiàn)， MVs和miR-200b-MVs可以在結(jié)腸定植，并且中藥復方苦參湯對其向結(jié)腸歸巢有促進作用。與正常組相比，模型組大鼠E-cad表達降低，vimentin、α-SMA、ZEB1和ZEB2的表達升高，經(jīng)miR-200b-MVs以及復方苦參湯治療后，與模型組相比，大鼠E-cad表

15、達升高，vimentin、α-SMA、ZEB1和ZEB2的表達降低；在細胞實驗部分，與正常組相比，模型組E-cad，表達減少，vimentin， ZEB1和ZEB2表達上升，加入miR-200b-MVs后，與模型組相比，E-cad，表達升高，vimentin，ZEB1和 ZEB2表達減少。二聯(lián)組比單一的 null-MVs（或miR-200b-MVs）組更能促進E-cad的表達，抑制vimentin，ZEB1和ZEB2的表達。