綠膿桿菌RNA降解蛋白質(zhì)PNPase和腸沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白質(zhì)fliD的初步晶體學(xué)研究.pdf

1、背景： RNA降解復(fù)合體是RNA在生物體內(nèi)更新的主要工具。PNPase通過(guò)的3’到5’核酸外切酶降解RNA。RraA是RNA降解復(fù)合體降解RNA過(guò)程中的重要抑制因子。鞭毛是細(xì)菌的重要成分也是致病因子之一,鞭毛的組裝是一個(gè)多蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜的過(guò)程。前期研究中成功解析了鞭毛FlgD蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和純化了Rnase E抑制因子。通過(guò)對(duì)PNPase和RraA結(jié)構(gòu)研究更能揭示RNA降解及其調(diào)節(jié)過(guò)程,通過(guò)對(duì)FliD結(jié)構(gòu)研究進(jìn)一步了解鞭毛的組裝機(jī)制。

2、r>　　 目的：本研究將對(duì)蛋白質(zhì)PNPase、RraA和FliD純化,得到這三個(gè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)晶體,收集X-光衍射數(shù)據(jù)并解析他們的三維結(jié)構(gòu)。
　　 方法：運(yùn)用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析,通過(guò)分子克隆技術(shù),克隆、表達(dá)、純化大量的純度大于95％的綠膿桿菌RNA降解酶PNPase蛋白質(zhì)、綠膿桿菌Rnase E抑制因子RraA蛋白質(zhì)和FliD蛋白質(zhì)。用凝膠層析法檢測(cè)目的蛋白質(zhì)在溶液中的聚集狀態(tài)。用晶體篩選試劑盒對(duì)目的蛋

3、白質(zhì)篩選蛋白質(zhì)晶體,并對(duì)初步得到的晶體進(jìn)行優(yōu)化,以獲得高質(zhì)量的晶體。用X衍射儀收集到得到蛋白質(zhì)晶體的衍射數(shù)據(jù)。通過(guò)Pull-down方法驗(yàn)證了PNPase和Rnase E的相互作用,并純化出該復(fù)合物用于晶體篩選。
　　 結(jié)果：通過(guò)分子克隆的技術(shù),成功克隆、表達(dá)、純化了綠膿桿菌PNPase、Rnase E和RraA蛋白質(zhì),和腸沙門(mén)氏菌鞭毛帽FliD蛋白質(zhì)。PNPase、RraA和FliD過(guò)分子篩Superdex200中顯示在溶液中