鼠傷寒沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白刺激小鼠細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答及鞭毛蛋白佐劑效應(yīng)的初步研究.pdf

1、細(xì)菌鞭毛有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，具有很強(qiáng)的抗原性(H抗原)，有利于細(xì)菌入侵。鞭毛蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生前炎性因子，在連接天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中起重要作用。新城疫(Newcastle disease，ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一，是國(guó)際獸疫局(OIE)規(guī)定的法定通報(bào)疾病。有報(bào)道證實(shí)，位于NDV囊膜上的F蛋白與病毒的致病性有關(guān)，參與病毒穿透、細(xì)胞融合，除此之外還具有良好的免疫原性，是NDV主要的保護(hù)性抗原。 本研究以含有新城疫

2、病毒F48E8株全長(zhǎng)的融合蛋白(F)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-F為模板，擴(kuò)增出594 bp大小的F基因的部分片段。經(jīng)克隆篩選和測(cè)序，構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-I-F。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，獲得重組菌BL21(pGEX-6P-1-F)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)分析表明，F(xiàn)基因在原核表達(dá)體系中高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的23％。Western blot結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量46 KD位置有特異性條帶。運(yùn)

3、用M-肉湯培養(yǎng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL7207獲得細(xì)菌的鞭毛蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析表明，獲得較純的鞭毛蛋白。Western blot結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量51KD位置有特異性條帶。 使用濃度為0.5μg/ml、1μg/ml的去內(nèi)毒素鞭毛蛋白刺激C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞( Macrophage，Mφ)2、4、6h。用細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)β-actin、IL-1β、TNF-α、IL-6基因表達(dá)。1.5％瓊脂

4、糖凝膠電泳驗(yàn)證鞭毛蛋白在2h時(shí)已能刺激細(xì)胞表達(dá)IL-1β、TNF-α、IL-6基因；0.5μg/ml濃度的鞭毛蛋白已能刺激細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答，轉(zhuǎn)錄IL-1β、TNF-α、IL-6。 使用10μg/ml濃度的鞭毛蛋白刺激小鼠腹腔Mφ2 h、12 h，以FACS檢測(cè)細(xì)胞表面F4/80+-FITC/CD80-biotin，F(xiàn)4/80+-FITC/CD86-biotin的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與2h相比12h時(shí)細(xì)胞表達(dá)的CD80，CD86分子明顯

5、升高。以10μg/只劑量腹腔注射BALB/c小鼠，分別作用12h、24 h。分離小鼠脾臟低浮密度細(xì)胞(Low-density cell，LDC)，F(xiàn)ACS檢測(cè)細(xì)胞表面CDllc-FITC/CD40-biotin、CDllc-FITC/CD80-biotin、CDllc-FITC/CD86-biotin的表達(dá)量。結(jié)果表明，LDC表面CD40、CD86分子在12 h組、24 h組表達(dá)量均呈現(xiàn)上升，12 h組較24 h組高。CD80分子未出現(xiàn)

6、明顯的變化。 選取4h和0.5μg/ml濃度的鞭毛蛋白、F蛋白、鞭毛蛋白+F蛋白刺激小鼠腹腔Mφ。經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，鞭毛蛋白組和鞭毛蛋白+F蛋白組均能刺激細(xì)胞產(chǎn)生明顯的前炎性因子應(yīng)答，而F蛋白刺激細(xì)胞產(chǎn)生的前炎性因子應(yīng)答較弱。 分別使用PBS、鞭毛蛋白、F蛋白、F蛋白+鞭毛蛋白、F蛋白+弗氏佐劑以皮下注射方式免疫小鼠，F(xiàn)蛋白的免疫劑量為80μg/只，鞭毛蛋白的免疫劑量為10μg/只。三免后可測(cè)得F蛋白4鞭毛蛋